miRNA-326及N-ras 基因在儿童急性淋巴细胞白血病中的研究

王利霞，李素颜

（1.安阳市人民医院检验科；2.安阳市人民医院血液肿瘤科，河南 安阳 455000）

急性淋巴细胞白血病（ALL）是起源于骨髓造血干细胞的血液系统恶性克隆性疾病，其发病率、复发率和死亡率均高[1]。ALL的治疗手段有化疗、免疫靶向治疗和骨髓移植等。尽管这些治疗手段有一定的疗效,但复发仍然是ALL治疗的主要障碍之一[2-3]。因此,寻找ALL新的治疗靶点，研究其发病机制,对提高ALL患者的治疗效果起着极其重要的作用。miRNA-326作为microRNA分子家族中的一员,在急性白血病中的作用逐渐受到人们的关注。本文通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测miRNA-326在儿童ALL中的相对表达量,使用单链构象多态性 PCR（Single strand conformation polymorphism PCR，PCR-SSCP）检测N-ras基因在治疗1年后的微小残留病（minimal residual disease，MRD）中的变化,以期为儿童ALL的诊疗及监测复发提供分子学标志。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象 选取2016年2月-2017年2月在我院血液科就诊的儿童ALL患者35例,其中男20 例,女 15 例,中位年龄 6 岁（0.5～13 岁），均为初治患者,无其他恶性肿瘤史,未接受过抗肿瘤治疗。诊疗及分型标准参照French-America-British(FAB)、World Health Organization(WHO)和《血液病诊断及疗效标准》(第三版)。同时选取非白血病儿童35例作为对照组，其中男19例，女16例，中位年龄7岁（1～12岁）。两组患者在年龄、性别、基础疾病等方面差别无统计学意义。

1.1.2 儿童ALL临床化疗方案 将所有初治ALL患儿根据有无危险因素分为标危组、中危组及高危组，依据CCLG-2008方案分5个阶段进行化疗治疗：诱导缓解治疗（使用VDLD2方案：强的松、长春新碱，柔红霉素，左旋门冬酰胺酶，地塞米松），早期强化治疗（使用CAM方案：CTX，阿糖胞苷，6-巯基嘌呤），巩固治疗（使用HD-MTX+6-MP方案：HD-MTX+6-巯基嘌呤），延迟强化治疗（使用 a：VDLD3—b：CAM 方案，a：长春新碱，阿霉素，左旋门冬酰胺酶，地塞米松，b：CTX，阿糖胞苷，6-巯基嘌呤），维持治疗（6-MP+MTX/VD+IT方案：6-巯基嘌呤，CTX/地塞米松，长春新碱）。

1.1.3 微小残留病检测 治疗1年后,取患者骨髓进行检测是否有微小残留病 （MRD）,若患者检出MRD,则认为化疗效果差和对化疗药物耐药。对MRD患者进行PCR-SSCP,以分析N-ras基因的表达。

1.2 主要仪器与试剂 人淋巴细胞分离液（Ficoll分离液）购于天津灏洋生物有限公司；Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司；DNA提取、逆转录、PC R、RT-PCR试剂盒及MiRNA-326试剂盒均购于美国ABI公司；引物由上海生工公司合成。低温高速离心机购于长沙湘仪仪器公司，小型超速离心机及移液器购于德国eppendorf公司,real-time PCR检测仪7500、购于美国ABI公司,minicycler PCR扩增仪购自美国Perkin Elmer公司。

1.3 RT-PCR方法检测miRNA-326

1.3.1 骨髓单个核细胞的分离 抽取患者骨髓2～5ml，采用肝素进行抗凝处理。使用人淋巴细胞分离液（Ficoll分离液）进行骨髓单个核细胞的分离。

1.3.2 总RNA的提取及纯度、浓度检测 将1.3.1中的骨髓单个核细胞，根据Trizol试剂盒的说明书进行总RNA的提取,紫外线分光光度计A260/A 280比值下测量OD值计算总RNA纯度及浓度的检测。

1.3.3 加尾法抽提mi-RNA及RT-PCR检测 、使用Poly(A)Tailing Kit试剂盒按说明书进行5’末端加尾。、cDNA合成：使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒按照说明书进行逆转录反应合成 cDNA：100mm dNTPs 0.15 μl，Multi-ScribeTM Reverse Transcriptase 1.0 μl，10 ×RT Buffer 1.5 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl，Nuclease free water 4.16 μl，5×RT primer 3 μl，total RNA 5 μl。整个过程于冰上完成，逆转录的条件为：16℃30 min;42℃30 min;85℃5 min。RT-PCR反应：20μl反应体系如下：TaqMan MicrRNA Assay（20×）1μl，product from RT reaction 1.33 μl，TaqMan 2×Universal Master Mix 10 μl,Nuclease-free water 7.67μl。循环条件为：95℃变性 15s，60℃条件下退火或延伸1min，进行40个循环。反应中以U6作为内参基因，miRNA-326引物顺序见表1。所有试验在不同时间点进行至少3次重复,计算各组2-△△Ct值。

表1 miRNA-326、5s及U6 snRNA引物序列

1.4.1 DNA的提取 取MRD患者（MRD+）骨髓2～5ml，按照酚-氯仿法提取DNA，经Ficoll分离液裂解，蛋白酶K进行消化，氯仿、酚和异戊醇等有机物进行抽提,无水乙醇进行沉淀。提取后的DNA用电泳鉴定，若为完整的基因组DNA则置于-80℃备用。试验对照组为ALL患儿中无MRD者（MRD-）。

1.4.2 PCR扩增将1.4.1中提取的DNA样本作为模板，使用minicycler PCR扩增仪进行扩增。所用N-ras基因引物为：上游5’-GACTGAGTACAAACT GGTGG-3’,下游 5’-CTCTATGGTGGGATCATATT-3’。 整个反应体系为 50μl，10×buffer 5μl,上下游Primer 各 1.5μl，4×dNTP 1μl，DNA 1μl。扩增反应条件为97℃变性10s,加Taq酶 2U，94℃变性60s,55℃退火50s,72℃延伸60s,共进行30个循环。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳经溴乙锭染色后检测。

1.4.3 SSCP分析PCR产物 PCR扩增产物8μl，变性液（95%甲酰胺+0.05%溴酚蓝+20mmol/L EDTA）8μl，100℃沸水中变性10min,取出后即刻置于冰水中骤冷15min，进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,160v电压下电泳6-8h。结束电泳后，使用2%硝酸银进行染色30min,再加入2.5%Na2CO3和0.1%甲醛的混合液,当出现清晰电泳带后加入10%醋酸溶液进行固定，置凝胶成像系统中观察结果。

1.5 统计分析 数据统计分析使用SPSS 17.0软件，所测试验数据以均数±标准差()表示，儿童ALL组和对照组比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-326在儿童ALL中的表达 研究结果显示，儿童ALL组miRNA-326相对表达量明显低于对照组，差异具有统计学意义,见表2。

表2 儿童ALL组和对照组miRNA-326的相对表达水平

2.2 MRD患者N-ras基因突变分析 35例儿童ALL患者中，发生MRD者为9例（10/35,25.57%）。9例MRD患者进行PCR-SSCP分析，SSCP的电泳结果显示：对照组MRD-者N-ras基因PCR扩增的产物呈一条整齐的条带，未见明显基因突变。而试验组9例MRD+者中有4例N-ras基因的PCR扩增产物通过SSCP电泳出现泳动速度比对照组快的异常条带。这表明4例MRD+患者发生N-ras基因突变，突变发生率为44.44%。

3 讨论

ALL是最常见的儿童恶性肿瘤,其发生机制涉及癌基因的激活以及抑癌基因的失活,是引起白血病细胞发生突变的病理生理学基础[4-5]。

miRNAs为非编码RNAs,其生物学功能在各种疾病的发生中均发挥着作用,通过与靶基因的mRNA作用，使得靶基因的mRNA发生降解，涉及的调控机制复杂多样[6-7]。目前，miRNA在急性白血病中的研究逐渐受到人们的关注,包括miRNA-150、miRNA-335、miRNA-93 等[8-10]，而 miRNA-326在急性白血病中的研究尚少。miRNA-326是miRNAs家族成员之一，通过对靶基因的调控从而导致上游基因转录水平的异常表达,引起造血系统及免疫系统的紊乱,最终引起白血病或者肿瘤的发生[11-12]。

本研究通过RT-PCR检测miRNA-326在儿童ALL中的相对表达量,结果显示儿童ALL组miRNA-326相对表达量（2.22±0.72）明显低于对照组（6.35±1.23），差异具有统计学意义（P＜0.05）。 这表明miRNA-326在儿童ALL的发生发展中发挥着非常重要的抑癌作用,结果与Ghodousi ES等[13]的研究结果一致。

PCR-SSCP是一种检测基因突变的经典方法[14]。本研究通过PCR-SSCP技术检测儿童ALL患者发生微小残留病（MRD）者中的N-ras基因突变,结果显示MRD+组较MRD-组的电泳速度快，有电泳位置和条带含量的改变。这验证了刘红等[15]人的研究结果，表明在ALL患者体内存在N-ras基因，故检测MRD者N-ras基因的突变情况，有助于诊断白血病的复发。

综上所述，miRNA-326在儿童ALL中的相对表达量明显下降，N-ras基因在微小残留病中存在突变,故miRNA-326和N-ras基因的检测可作为儿童ALL诊断及复发的生物学标志,也可为白血病的耐药性监测和治疗提供新的靶点。