荔枝皮多酚纯化工艺的优化研究

周秋艳 唐方华 蒋旭红 郑志鹏 谢小燕

摘要 [目的]以荔枝皮为原料，优化荔枝皮多酚的纯化工艺，提高荔枝多酚资源利用率。[方法]以多酚纯度及收率为衡量指标，通过对比7种大孔树脂的静态吸附与解吸，确定纯化荔枝皮多酚的最佳树脂;通过大孔树脂动态吸附与洗脱，考察吸附量、洗脱溶剂、洗脱溶剂用量、洗脱速度等因素，确定荔枝皮多酚纯化的最佳工艺。[结果]筛选出DM21大孔树脂作为最佳纯化材料，DM21纯化荔枝皮多酚的最佳工艺如下：吸附量93.4 mg/mL、洗脱溶剂为90%乙醇、洗脱溶剂用量1.5 BV、洗脱速度1.5 BV/h。在此最优条件下，荔枝皮多酚平均纯度为32.27%，平均转化率为69.03%。[结论]大孔树脂DM21纯化荔枝皮多酚效果良好，值得推广应用。

关键词 荔枝皮多酚;纯化;大孔树脂;静态吸附与解吸;动态吸附与洗脱

中图分类号 TS209文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0187-03

Abstract [Objective]To optimize the purification process of polyphenols from litchi pericarp by using litchi pericarp as raw material，and improve the utilization rate of litchi polyphenols.[Method]Based on the purity and yield of polyphenols，the best resin for purifying polyphenols from litchi pericarp was determined by comparing the static adsorption and desorption of seven kinds of macroporous resins.Based on the dynamic adsorption and elution of macroporous resin，the adsorption amount，elution solvent，elution solvent dosage and elution rate were investigated to determine the optimal process for purifying polyphenols of litchi pericarp.[Result]The macroporous resin DM21 was selected as the best purification material.The optimal process for purifying polyphenols from litchi pericarp by DM21 was as follows：adsorption amount 93.4 mg/mL，elution solvent 90% ethanol，the dosage of elution solvent 1.5 BV，elution rate 1.0 BV/h.Under these optimal conditions，the average purity of polyphenols from litchi pericarp was 32.27%，and the average yield was 69.03%.[Conclusion]The purification of polyphenols from litchi pericarp by using macroporous resin DM21 is effective，which is worthy of popularization and application.

Key words Polyphenols from litchi pericarp;Purification;Macroporous resin;Static adsorption and desorption;Dynamic adsorption and elution

植物多酚（plant polyphenols），又稱植物单宁或鞣质（tannins），是一类广泛存在于高等植物体内的多元酚类化合物[1]，其结构复杂，已被证实具有多种功效，如抗氧化作用[2]，能有效预防高血脂、高血糖、心脑血管等慢性疾病[3]，还具有抵抗神经性疾病和降低癌症风险等作用[4]，食品、药品、营养保健等众多领域均能得到广泛应用[5]。

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）为无患子科（Sapindacea）荔枝属植物荔枝的果实，主要生长在亚热带地区。我国是荔枝生产大国，主要产地为广东、福建、广西、海南等。荔枝果皮目前作为荔枝加工的生产废弃物，尚未得到有效利用。研究表明，荔枝果皮含有多酚物质，为荔枝主要功能成分之一，已有报道称荔枝酚类物质具有多种生物活性，如降血糖、抗氧化、抗肿瘤等[6-8]。

分离纯化多酚类物质的方法有很多，常见的方法包括有溶剂萃取法、沉淀分离法、大孔树脂吸附法、膜分离技术及逆流色谱技术等[9]。其中，大孔树脂吸附法具有生产效率高、成本低且操作简便易行、选择性好、吸附容量大、树脂可再生重复利用等优点，将广泛应用于工业化制备天然产物中[10]。采用大孔树脂分离纯化多酚类物质的研究已有大量报道，如大孔树脂分离纯化苹果多酚、葡萄多酚、枣类多酚等[11-13]，但关于荔枝皮多酚类物质的分离纯化则鲜见报道。

笔者以荔枝皮为原料，采用大孔树脂对荔枝皮中多酚类物质的分离纯化工艺进行了研究，以期开发一种具有良好生理活性的、新的植物多酚材料，同时为拓展荔枝深加工产品领域、综合利用荔枝资源提供一条有效途径 。

1 材料与方法

1.1 原料和试剂

1.1.1 原料。“淮枝”品种荔枝皮，取自广州市从化区明珠市场的荔枝整果。

1.1.2 试剂。没食子酸，购自中国食品药品检定研究院;福林酚，购自中国食品药品检定研究院;大孔树脂LSA-12、XDA-8、LX-T28、LX-8、D101，购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司;大孔树脂DM21、DM28，购自艾美科健（中国）生物医药有限公司;95%乙醇，分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂;甲醇，分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂;碳酸钠，分析纯，购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2 主要仪器与设备

DMF-10A多功能摇摆式粉碎机（浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司）、DMF-4B手提式高速中药粉碎机（浙江温岭市铭大药材机械设备有限公司）、2WAJ阿贝折射仪（上海仪电物理光学仪器有限公司）、LT-1002电子天平（常熟市天量仪器有限责任公司）、ATX224分析天平（岛津制作所）、TD-5M离心机（山东博科科学仪器有限公司）、SP-752PC紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、5L旋转蒸发器（上海大颜仪器设备有限公司）、EXRE-2002旋转蒸发器（巩义市宇翔仪器有限公司）、DHG-9240A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、DZF-6053真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 荔枝皮提取浓缩液的制备

新鲜荔枝皮60 ℃烘8 h，粉碎至粗粉，备用。荔枝皮第1次提取：温度60 ℃、70%乙醇、料液比1∶7，提取60 min。药渣第2次提取：温度60 ℃、70%乙醇、料液比1∶6，提取60 min。然后，合并2次提取液。60 ℃减压浓缩至无醇后，浓缩液4 000 r/min离心6 min，得到荔枝皮提取浓缩液，冷藏保存备用。

1.4 没食子酸标准曲线的绘制

准确称取（0.110±0.010）g 没食子酸，用蒸馏水溶解，然后定容至100 mL，即为没食子酸标准储备溶液。准确量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准储备溶液置于100 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL，即为没食子酸工作液。准确量取1.0 mL没食子酸工作液置于刻度试管中，分别加入5.0 mL 10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min;加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液，摇匀，室温下放置60 min，于765 nm波長下使用紫外可见分光光度计测定吸光度（A），绘制标准曲线。空白用蒸馏水代替没食子酸标准溶液。

1.5 多酚含量的检测

称取待检测样品置于10 mL离心管中，加入70 ℃预热过的70%甲醇溶液5 mL，搅拌均匀，立即移入70 ℃水浴10 min，冷却至室温，3 500 r/min转速离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶;将沉淀再加入5 mL 70%甲醇溶液，重复以上操作;合并提取液定容至10 mL，摇匀，再准确量取1.0 mL置于100 mL容量瓶中，摇匀，待测。从100 mL容量瓶中准确量取1.0 mL样品溶液置于刻度试管中，分别加入5.0 mL 10%福林酚试剂，摇匀，反应3～8 min后，加入4.0 mL7.5% Na2CO3溶液，摇匀后室温下放置60 min，空白用蒸馏水代替样品溶液。在765 nm波长下测定样品吸光度，计算样品中多酚的含量。

1.6 大孔树脂的预处理

95%乙醇浸泡大孔树脂24 h，使其充分溶胀，然后将大孔树脂装柱，用95%乙醇冲洗，直至洗出液加适量纯化水后无白色浑浊现象出现，再用纯化水洗至无醇，即可使用。

1.7 大孔树脂的静态吸附

取荔枝皮提取浓缩液适量，用纯化水稀释至固形物≤5%，得到荔枝皮提取稀释液，备用;

将预处理过的型号分别为LSA-12、XDA-8、LX-T28、LX-8、D101、DM21、DM28树脂中每种树脂各取5份，每份重量为16.0 g，共计35份，分别置于250 mL锥形瓶中，然后分别加入100 mL荔枝皮提取稀释液，于摇床中振荡吸附12 h（振速为150 r/min）后抽滤，并用纯化水冲洗至抽滤液为无色为止，合并同一树脂型号抽滤液，并分别向抽滤后树脂中加入100 mL体积分数70%的乙醇振荡解吸12 h，分别收集抽滤液，检测，以荔枝皮多酚纯度和收率为考察指标，筛选出分离纯化荔枝皮多酚的大孔树脂。

1.8 大孔树脂的动态吸附

量取荔枝皮提取浓缩液，用纯化水稀释至固形物≤5%，得到稀释液，备用; 采用大孔树脂法对荔枝皮多酚进行纯化。将静态吸附试验筛选出的树脂湿法装柱，进行试验确定大孔树脂吸附量，考察洗脱溶剂、洗脱溶剂用量、洗脱速度等因素对多酚多酚纯度以及收率的影响。

2 结果与分析

2.1 没食子酸的标准曲线

以没食子酸浓度为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程：y=0.011 5x+0.005 4（R2=0.998 7）。没食子酸的标准曲线见图1。

2.2 大孔树脂的静态吸附

7种大孔树脂对荔枝皮多酚的纯度和收率见图2。从图2可以看出，大孔树脂LSA-12、XDA-8、LX-T28、LX-8、D101、DM21、DM28的荔枝皮多酚纯度分别为29.99%、21.40%、29.05%、46.78%、28.49%、26.08%和26.63%，多酚收率分别为59.49%、47.37%、58.17%、31.15%、58.78%、64.08%和65.19%，虽然LSA-12、LX-T28、LX-8和D101多酚纯度高于DM21、DM28，但其多酚收率明显较低，又因大孔树脂DM28易结块，因此选择大孔树脂DM21进行下一步试验。

2.3 大孔树脂的动态吸附

2.3.1 大孔树脂吸附量的确定。

将大孔树脂DM21装柱，≤5%固形物稀释液过柱，流速1.0 BV/h，以流出液固形物含量为衡量指标，确定吸附量。大孔树脂DM21上柱流出液固形物含量的动态曲线见图3。由图3可知，大孔树脂DM21流出液固形物含量在3.5～7.0 h保持不变，说明3.5 h后树脂的吸附量达到饱和，此时树脂的吸附量为39.30 g，装柱体积为420 mL，表明后续试验吸附量分别按总固形物∶树脂体积=1∶10.71（g/mL）装柱即可。这是因为大孔树脂对物质的吸附量是有限的，达到其吸附量时则不再吸附物质，因此认为其吸附饱和。

2.3.2 洗脱溶剂乙醇浓度的确定。

在确定吸附量的基础上，分别用10%、30%、50%、70%、90%乙醇进行分段洗脱，洗脱速度1.0 BV/h，每段洗脱溶剂用量0.75 BV，收集洗脱液，浓缩、干燥，以不同乙醇浓度洗脱液的多酚收率累积百分比为衡量指标，确定洗脱溶剂乙醇的浓度。不同乙醇浓度对大孔树脂DM21洗脱液多酚收率的影响见图4。由图4可知，70%乙醇仅能洗脱多酚收率的84.53%，90%乙醇才能洗脱多酚收率的95%以上，故试验选择90%乙醇作为最佳洗脱剂。

2.3.3 洗脱溶剂用量的确定。

在确定吸附量以及洗脱乙醇浓度的基础上，采用2.5 BV体积洗脱溶剂进行洗脱，每0.5 BV体积收集1次，以洗脱液中的多酚收率累积百分比为衡量指标，确定洗脱溶剂用量。不同洗脱溶剂用量对大孔树脂DM21洗脱液多酚收率累积百分比的影响见图5。由图5可知，随着洗脱溶剂的增加，多酚收率累积百分比呈现上升的趋势。当洗脱溶剂为0.5～1.5 BV时上升趋势急剧加快，当洗脱溶剂为1.5～2.5 BV时上升趋势不明显。这是因为随着洗脱溶剂的增加，多酚被逐渐洗脱下来，当达到一定量时多酚基本洗脱完全。综合考虑，在多酚被充分洗脱的前提下，出于经济考虑，应尽量节省洗脱剂的用量，故该试验选择1.5 BV为最佳洗脱溶剂用量。

2.3.4 洗脱速度的确定。

在确定吸附量、洗脱乙醇浓度90%和洗脱溶剂用量1.5 BV的基础上，分别以洗脱速度0.5、1.0、1.5 BV/h进行洗脱，以洗脱液多酚收率为衡量指标，确定洗脱速度。不同洗脱速度对大孔树脂DM21洗脱液多酚收率的影响见图6。由图6可知，随着洗脱速度的增加，多酚收率无明显变化。在实际应用中，洗脱流速过慢会使生产效率降低，成本增加。因此，当使用大孔树脂DM21进行荔枝皮多酚纯化时，最佳洗脱速度为1.5 BV/h。

2.4 验证试验

按照大孔树脂动态吸附试验确定的大孔树脂DM21、洗脱溶剂90%乙醇、洗脱溶剂1.5 BV、洗脱速度1.5 BV/h，进行3个平行试验，荔枝皮多酚纯度分别为31.89%、32.93%和31.99%，平均值为32.27%，相对标准偏差（RSD）为1.78%;荔枝皮多酚收率分别为69.26%、68.07%和69.76%，平均值为69.03%，相对标准偏差（RSD）为1.26%，表明该纯化工艺稳定、可行。

3 结论与讨论

通过大孔树脂的静态试验和动态试验，确定荔枝皮多酚纯化的最优树脂为DM21，最优工艺参数如下：吸附量93.4 mg/mL、洗脱溶剂90%乙醇、洗脱溶剂1.5 BV、洗脱速度1.5 BV/h。在此最优条件下，荔枝皮多酚平均纯度以及收率比较理想，可以很好地分离纯化荔枝皮多酚。

前人已对荔枝皮多酚的分离纯化进行了研究，如熊何健等[14]用8倍体积50%（V/W）的丙酮溶液在室温下浸提荔枝壳2次，每次浸提2 h，回收溶剂，荔枝多酚粗提物得率为34.2%。粗提物经AB-8型树脂柱层析纯化，30%乙醇洗脱组分的多酚回收率为86.8%，纯度为30.0%。该研究结果表明，DM21大孔树脂是纯化荔枝皮多酚的理想吸附树脂，具有纯化效果良好、解吸率高等特点，荔枝皮多酚的动态平均多酚收率为69.03%，相对较低，但多酚平均纯度较高，达32.27%。该研究中优化后的纯化工艺操作简单，大孔树脂以及用于洗脱的乙醇溶液可重复利用，既节约了成本，又减少了对环境的污染，可用于工业化生产。

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