产紫丁香苷内生细菌CX33的鉴定及活性研究

王宇晴 卢玢宇 刘松梅 郑春英

摘要 [目的]研究内生细菌CX33的活性作用及活性代谢物，探讨其与宿主植物刺五加的相关性。[方法]对内生细菌CX33进行抑菌活性研究;结合形态学特征、生理生化特性及16S rDNA序列同源性分析对该菌株进行鉴定;采用HPLC法对CX33发酵液中活性代谢物进行分析。[结果]内生细菌CX33具有较好的抑菌活性;经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）;经检测该菌株发酵液中含有紫丁香苷。[结论]内生细菌CX33为紫丁香苷产生菌，该菌可能与宿主植物刺五加具有相同的代谢机制。

关键词 内生细菌;抑菌活性;鉴定;紫丁香苷

中图分类号 R284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0184-03

Abstract [Objective]The research aimed to study the activity and active metabolites of endophytic bacteria CX33， and to explore its correlation with the host plant Acanthopanax senticosus.[Method]The antibacterial activity of endophytic bacteria CX33 was studied. The morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence homology analysis were used to identify the strain. The active metabolites in CX33 fermentation broth were analyzed by HPLC.[Result]The endophytic bacteria CX33 had good antibacterial activity; the strain was identified as Bacillus subtilis;the fermentation broth of the strain was tested to contain syringin.[Conclusion]The endophytic bacteria CX33 is a syringinproducing bacterium， which may have the same metabolic mechanism as the host plant Acanthopanax senticosus.

Key words Endophytic bacteria;Bacteriostatic activities;Identification;Syringin

内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中形成了互惠共生关系。宿主植物为内生菌生长发育提供必须的生态环境，避免外界生物或非生物的干扰等[1];同时，内生菌代谢产物能够刺激植物生长发育，提供宿主植物对环境胁迫的抵抗能力[2]，刺激宿主产生各种次生代谢产物以维护机体的健康[3]。因此研究内生菌活性代谢物对于表达其与宿主植物的相关性具有重要意义[4-5]。

刺五加（Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms）为北方濒危药用植物[6]，具有多种活性作用[7]，现广泛应用于食品、药品领域。笔者以刺五加内生细菌CX33为研究对象，对其开展活性研究;同时也对其发酵液中次生代谢产物进行分析，并对其进行菌种鉴定，为综合利用该菌株、采用微生物发酵法生产刺五加活性成分奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养

供试菌：刺五加内生细菌CX33由黑龙江大学生物制药专业实验分离得到。

NA培养基、PDA培养基（见文献[8]）。

16Sr DNA序列扩增引物（上海生工生物工程股份有限公司）。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪（型号：FL2200，产地：浙江温岭）。

试剂：甲醇为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.3 内生细菌CX33发酵液供试品的制备

取已活化的CX33菌株接種于NA液体培养基中，120 r/min，37 ℃振荡发酵培养5 d，取出，于2 000 r/min离心10 min，得发酵液，冻干，备用。

1.4 抑菌活性检测

取“1.3”的供试品，以适量甲醇溶解成1 mg/mL的供试品溶液，过滤（0.22 μm无菌滤器），参照文献[9]进行抑菌活性检测。

1.5 内生细菌CX33菌株鉴定

内生细菌CX33形态学观察及生理生化指标测定参照文献[10]进行。

16S rDNA序列扩增和序列分析参照文献[8]进行。

1.6 内生细菌CX33发酵液分析

采用HPLC对CX33菌株发酵液中活性成分进行分析。取“1.4”项供试品溶液，微孔滤膜过滤（0.45 μm），取滤液作为供试品溶液。分别精密吸取紫丁香苷对照品溶液及供试品溶液各10 μL注入色谱仪，色谱柱：Venusil XBP-C18柱;流动相：甲醇-水-冰醋酸（15∶85∶1）;流速1 mL/min;检测波长269 nm。

2 结果与分析

2.1 抑菌活性检测

刺五加内生细菌CX33发酵液对11种致病菌均有不同程度的抑制作用，结果见表1。

2.2 内生细菌CX33菌株鉴定结果

2.2.1 内生细菌CX33菌株形态学观察及生理生化指标测定。CX33菌株形态学观察及生理生化指标测定结果见表2。

2.2.2 16S rDNA序列扩增和序列分析。

CX33菌株PCR扩增后得到1条1 540 bp的特异性条带，通过GENBANK序列比对，CX33与枯草芽孢杆菌MX6（序列号：KY575151.1）株序列相似性达到96%，综合生理生化和16S rDNA基因序列的分析结果，鉴定菌株CX33为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。菌株CX33系统发育树见图1。

2.3 内生细菌CX33发酵液分析

通过HPLC法，以紫丁香苷为对照，对CX33发酵液中活性成分进行分析，结果发现，采用对照品加入法在CX33发酵液中检测到紫丁香苷，而阴性对照（培养基）无干扰。其结果如图2～5所示。

3 结论

刺五加内生细菌CX33发酵液中存在与宿主植物刺五加相同的活性成分紫丁香苷，说明刺五加内生细菌CX33在次生代谢产物产生机制方面与宿主植物刺五加有着相似之处;同时，在刺五加内生细菌CX33发酵液中也存在大量活性代谢物，因此开展刺五加内生细菌CX33活性代谢物研究具有重要意义，可为进一步研究和综合利用CX33菌株奠定基础。

参考文献

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[10] BUCHANAN R E，BERGEY N E.Bergeys manual of determinative bacteriology[M].9th ed.Baltimore：Williams & Wilkins Company，1994：198.