不同粒径银纳米颗粒在家蚕体内的转运·分布及代谢研究

张伟 徐晨 屠钰 李款 陈仲达 刘泽玉 李龙 武国华

摘要 以家蠶为模式生物，研究了2种不同粒径的银纳米颗粒[Ag NPs，直径分别为（23.2±2.8）nm和（47.6±5.2） nm，分别记为Ag NPs-23.2 nm及Ag NPs-47.6 nm]在家蚕体内的转运、分布和代谢。在家蚕5龄的第3天，将不同浓度的Ag NPs（60 μg/头、120 μg/头、180 μg/头）通过腹足注射的方式导入家蚕体内，分别于注射后24、48、72 h解剖家蚕，获得家蚕血液、丝腺和中肠，同时收集蚕砂，结茧后收集蚕丝，然后用微波消解结合电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定各组织及蚕砂、蚕丝中Ag的浓度。结果表明，不同组织中Ag的浓度随时间的变化趋势差异较大。120 μg/头Ag NPs注射24 h后，血液中Ag的浓度分别为（23.87±3.00）μg/mL（Ag NPs-23.2 nm）、6.54±0.33 μg/mL（Ag NPs-47.6 nm），中肠对应的Ag浓度分别为（200.34±12.11）μg/g（Ag NPs-23.2 nm）、（20.12±1.60）μg /g（Ag NPs-47.6 nm）。血液中Ag的浓度随着时间的推移而降低，而中肠中Ag的浓度则持续升高;蚕砂中Ag浓度也随时间而降低。由此可见，注射进入血液中的Ag NPs会向中肠转运，再通过代谢进入蚕砂而被排出体外。小粒径的Ag NPs更容易被家蚕吸收并在体内富集，而大粒径的Ag NPs更容易被代谢进入蚕砂。通过对不同粒径Ag NPs在家蚕体内的转运、分布和代谢的研究，可为Ag NPs的毒理研究提供了一定的支持。

关键词 纳米银颗粒;家蚕;电感耦合等离子体质谱;尺寸效应

中图分类号 S881文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0103-04

Abstract Taking silkworm as model organism，this paper studied the transport，distribution and metabolic of two different sizes of nanosilver particles （Ag NPs with particle size of （23.2±2.8） and （47.6±5.2） nm，respectively，denoted Ag NPs-23.2 nm and Ag NPs-47.6 nm） in silkworm.On the 3rd day of the 5thinstar silkworm，different concentrations （60，120，180 μg per silkworm） of Ag NPs were introduced into silkworm by gastropod injection.Silkworm blood，silk gland and midgut were obtained by dissecting silkworm 24，48 and 72 h after injection respectively.And silkworm feces was collected at the same time，silk was collected after cocooning，and then the concentration of Ag in various tissues and silkworm feces，silk was determined by microwave digestion combined with inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP-MS）.The results showed that the concentration of Ag in different tissues varied greatly with time. After injecting120 μg Ag per silkworm 24 h，the concentration of Ag in blood was （23.87±3.00） μg/mL （Ag NPS-23.2 nm） and （6.54±0.33） μg/mL （Ag NPS-47.6 nm） respectively， and the concentrations of Ag in midgut were （200.34±12.11） （Ag NPS-23.2 nm） and （20.12±1.60）μg/g （Ag NPS-47.6 nm），respectively.The concentrations of Ag in the blood decreased with the time，while the concentration of Ag in the midgut continued to increase.Ag concentration in silkworm feces also decreased with time.Therefore，Ag NPs injected into the blood would be transported to the midgut and then excreted out of the body through metabolism into silkworm feces.Smallsized Ag NPs was easier to be absorbed by silkworm and enriched in vivo，while largesized Ag NPs was easier to be metabolized into silkworm feces.The research on the transport，distribution and metabolism of Ag NPs with different sizes in silkworm body provided some supports for toxicological research of Ag NPs.

Key words Ag NPS;Silkworm;ICP-MS;Size effect

银是一种储量相对丰富、价格低廉且物理性能良好的贵金属，可被应用于表面增强拉曼散射（SERS）检测[1]、化学分析及单分子检测等领域。此外，银在所有金属中具有最好的电导和热导性能，可作为理想的电气元件和极好的催化剂[2]。随着纳米科技的不断发展，银纳米（AgNPs）良好的抗菌性能、光学性能以及其他特殊性能也被不断开发应用。AgNPs释放的Ag离子已被证实具有抗菌作用，这也是纳米毒理学关注的焦点之一[3]。目前，Ag NPs已被广泛应用于光电学、能源采集、催化材料、化工、生物传感、成像以及生物医学等领域。吴源[4]报道Ag NPs对生物有一定的毒性，但Ag NPs进入生物体内的转运方式、分布情况以及代谢机制仍不清楚。

家蚕（Bombyx mori L.）是一种完全变态的鳞翅目昆虫，其蚕丝可应用于纺织、制药以及医疗等领域，具有重要的药用及食用价值，同时亦可作为模式生物用于科学研究[5-7]。家蚕作为新兴的模式生物，具有世代短、子代多、遗传资源丰富以及基因与人类基因相似性高等优势[8]。

电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）是一种优异的元素分析技术，与传统的原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-OES）[9]相比，具有高灵敏度、谱线干扰少、分析速度快、所需的检测样品量少等特点[10]。

笔者以柠檬酸钠和单宁酸2种还原剂的组合还原硝酸银，合成了高度分散的2种不同粒径的Ag NPs[3]，并以家蚕作为模式生物，对Ag NPs进入家蚕体内后的转运、代谢及分布情况进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

试验用家蚕品种为菁松×皓月，由中国农业科学院蚕业研究所提供。硝酸银（AgNO3）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7）和单宁酸（C76H52O46）均购自国药公司;电子级硝酸购自阿拉丁试剂有限公司;质谱调谐液（Ba、Be、Bi、Ce、Co、In、Li、Ni、Pb、U浓度均为10 mg/L）;银标准溶液（浓度为1 000 mg/L）和铟标准溶液（浓度为1 000 mg/L，配制成5 μg/L 使用）均購自阿拉丁试剂上海有限公司;高纯氩气、氮气（纯度为99.999%），购自苏州金宏气体股份有限公司;超纯水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.2 主要仪器 HH-S2数显恒温水浴锅，为中国金坛市医疗仪器厂产品;台式离心机（Multifuge XIR），为美国Thermo Scientific公司产品;超声波清洗器（KH-700DE），为昆山禾创超声仪器有限公司产品;透射电子显微镜（Tecnai 12），为荷兰Philips公司产品;磁力搅拌器（C-MAG HS10），为德国IKA公司产品;电子天平（MS204S），为瑞士METTLER公司产品;紫外光度仪，型号UV-2450产于日本;ICP-MS X Series 2型电感耦合等离子体质谱仪，为美国Thermo Fisher公司产品;MARS Xpress微波消解仪，为美国CEM公司产品;BHW-09C恒温加热赶酸仪，为上海博通化学科技有限公司产品;超纯水机，为法国Millipore公司产品。

1.3 Ag NPs的合成与表征

将玻璃仪器用硝酸浸泡、超纯水清洗3遍后，放入60 ℃烘箱中备用。在含有转子的三口烧瓶中加入100 mL蒸馏水，再加入5 mmol/L的柠檬酸钠和适量的单宁酸，加热搅拌至沸腾后，加入1 mL 25 mmol/L的AgNO3溶液，该无色溶液立即变为亮黄色，加热保持沸腾反应30 min。反应完成后，冷却至室温，11 000 r/min离心（去除过量的单宁酸）20 min 3次，将离心后的银纳米分散在蒸馏水中。

参照文献[3]方法控制单宁酸浓度分别为0.25和 5.00 mmol/L，生成粒径分别为23和47 nm的Ag NPs。Ag NPs的大小通过调节单宁酸的浓度来控制。

取0.01 g Ag NPs置于20 mL烧杯中，加入10 mL超纯水，将其用磁力搅拌器搅拌30 min，随后将悬浊液倒入离心管中，100 Hz、25 ℃条件下超声10 min，使得Ag NPs均匀、充分地混合在水中。将混合液滴加在铜网支持膜上，然后将其放置在红外灯下干燥30 min，置于透射显微镜上观测。透射电镜结果表明，Ag NPs的实际粒径分别为（23.2±2.8）和（47.6±5.2）nm（图1），与预期结果基本相符。

1.4 Ag NPs注射试验

通过标准饲养技术将家蚕饲养至5龄第3天，挑选体重（2.00±0.2）g、体长（2.5±0.2）cm的家蚕用于后续试验研究。将挑选好的家蚕随机分成30组，每组数量为30头。

准确称取体重1.8 g、不同粒径的Ag NPs粉末置于100 mL容量瓶中，用超纯水定容，得到18 mg/mL的Ag NPs悬浮液。100 Hz、25 ℃条件下超声10 min，制得混合均匀的Ag NPs水混合液，再分别稀释至12和6 mg/mL。利用微量注射器将混合液通过腹足注射进家蚕体内，每头10 μL，注射前需对家蚕进行饥饿处理12 h，接受注射后的家蚕用新鲜桑叶正常饲养。

家蚕5龄第4、5、6天（即注射后24、48、72 h）每组分别随机取出5头进行解剖，依次取家蚕的血液、中肠、丝腺，并对蚕砂进行收集，取家蚕组织时，应尽量保持组织的完整性，血液要事先加入苯基硫脲，去除中肠上可能黏附的桑叶。选取丝腺时，保证前、中、后部丝腺被完整采集。解剖出的各组织用超纯水涮洗干净后与血液均置于-20 ℃冰箱中保存待用。

将每组剩余家蚕正常饲养至结茧，收集蚕茧。蚕茧用碳酸钠水溶液进行脱胶处理，烘干待测。

1.5 微波消解

将血液取出常温放置一段时间解冻，组织样品放置于烘箱中80 ℃干燥至恒重，然后将其研磨成粉末，准确取血液0.1 mL、组织样品、蚕丝和蚕砂均取0.1 g，对照组加入等体积的超纯水，将其放入消解罐中，随后加入5 mL的电子级硝酸，放置过夜后再向消解罐中加入3 mL的电子级硝酸，拧紧盖后将其放置在微波消解仪中进行消解，消解的参数见表1。消解后的样品需移入赶酸仪中进行赶酸，赶酸仪温度设置为145 ℃，时间70 min，等赶酸后的样品冷却至室温后，将样品倒入25 mL的容量瓶中，用1%稀硝酸定容，待测。

1.6 ICP-MS参数的选择与优化

按照优化后的质谱测定条件，选用铟为内标元素对标准浓度组、对照组和样品组进行测定。仪器参数的选择与优化如表2所示。

Ag浓度的计算公式如下：

固体组织：ω1=C×V×10-3m（1）

血液：ω2=C×V×10-3V0（2）

式中，ω1为固体组织中银元素的浓度，单位为μg/g;ω2为血液中银元素浓度，单位为μg/mL;C表示质谱测得的样品中的元素浓度，单位为μg/L;m表示固体样品取样量，单位为g;V表示消解后样品定容的体积，单位为 mL;V0表示血液取样的体积，单位为 mL。

2 结果与分析

2.1 精密度试验

为评估ICP-MS方法的精密度，使用家蚕的血液作为样品，制备组织匀浆，并稀释一定的倍数以获得高、中、低3种浓度水平。经检测分析可知，精密度为3.69%～5.24%，说明该方法具有较好的重现性。

2.2 家蚕不同组织及蚕砂中Ag的浓度

2.2.1 浓度为120 μg/头Ag NPs不同尺寸的比较。给家蚕注射Ag NPs后，利用ICP-MS对家蚕的血液、蚕砂以及各组织的Ag元素浓度进行测定，结果如图2所示。由图2可知，空白组（不注射Ag NPs）的测定值都小于0.1 μg/g，可认为空白组家蚕体内不含有Ag元素。血液中的Ag濃度第4～5天呈现明显下降的趋势，第5～6天维持在16.5 μg/g（Ag NPs-23.2 nm）和3.5 μg/g（Ag-NPs 47.6 nm）。与血液相比，中肠中Ag的浓度却呈明显上升的趋势。丝腺中Ag的浓度变化并不明显，第4～6天基本维持在同一水平，由此可推断Ag进入家蚕后会有部分转运到丝腺，24 h后丝腺中Ag浓度基本不变，说明不再进一步累积。第4天蚕砂中Ag的浓度明显高于第5～6天，第5～6天蚕砂中Ag的浓度维持在1 μg/g左右。由此可见，Ag NPs被注射进家蚕体内后进入血液中，导致血液中Ag浓度升高，然后会随着时间的推移向中肠转运，同时一部分会被代谢进入蚕砂，从而排出体外。第5～6天蚕砂中Ag的浓度很少，说明Ag作为一种重金属元素容易在体内富集，然后缓慢被代谢出体外。Chang等[11]给家蚕喂食Ag NPs也发现类似现象。

不同粒径的Ag NPs在家蚕体内的分布情况也有很大的差异。中肠和血液中小粒径（23.2 nm）Ag NPs的浓度比大粒径（47.6 nm）AgNPs的浓度高得多;蚕砂中却正好相反，粒径47.6 nm的Ag NPs浓度更高，说明大粒径的Ag NPs更容易排出体外。由此可见，小粒径的Ag NPs更容易被吸收在体内富集，而大粒径的Ag NPs更容易被代谢进入蚕砂。

丝腺中Ag浓度随着时间的变化并不明显，而蚕茧和脱胶丝中都检测到微量的Ag元素，说明丝腺中的Ag会在丝腺合成蚕丝的过程中进入蚕丝。23.2 nm和47.6 nm AgNPs组蚕茧中Ag的浓度分别为脱胶丝的6.3倍和2.2倍。由此可见，粒径23.2 nm的Ag进入蚕丝后容易分布于丝胶。

2.2.2 注射不同浓度Ag NPs后第5天Ag浓度的比较。注射不同浓度的Ag NPs后家蚕5龄第5天丝腺和中肠中Ag浓度的变化见图3。从图3可以看出，对于粒径为23.2 nm的Ag NPs组，当Ag NPs浓度从60 μg/头增加到120 μg/头，丝腺和中肠中Ag浓度分别增加了0.98倍和0.99倍;当Ag NPs浓度从120 μg/头增加到180 μg/头时，丝腺和中肠中Ag的浓度分别增加了1.07倍和0.31倍。对于粒径为47.6 nm的Ag NPs组，当Ag浓度从60 μg/头增加到120 μg/头时，丝腺和中肠中Ag浓度分别增加了1.01倍和1.00;当Ag浓度从120 μg/头增加到180 μg/头时，丝腺和中肠中Ag浓度分别增加了0.15倍和0.79倍。由此可见，小粒径的Ag NPs更容易在中肠中富集。

3 结论

该研究合成了2种不同粒径的Ag NPs，然后将其注射到家蚕体内，采用ICP-MS测定家蚕的血液、丝腺、中肠、蚕砂和蚕丝中Ag的浓度。结果表明，各组织中Ag的浓度随时间的变化而变化。其中，血液中Ag的浓度随时间的变化而逐渐降低;在注射后的24～72 h，中肠内Ag的浓度持续升高，表明Ag会在中肠中富集;丝腺中Ag的浓度在24～72 h基本保持不变;蚕砂中Ag的浓度在注射后24 h较高，此后Ag的浓度都维持在较低水平，表明转运入中肠的Ag会参与代谢并随着蚕砂排出体外，但这一过程在注射后大约24 h内比较突出。注射的Ag NPs浓度越大，中肠和丝腺中Ag的浓度就越大。小粒径的Ag NPs更容易被吸收、在体内富集，而大粒径的Ag NPs更容易被代谢进入蚕砂。Ag NPs会通过丝腺进入蚕丝，粒径23 nm的Ag NPs在丝胶中有更多分布。该试验初步研究了Ag NPs进入家蚕体内后的转运、代谢及分布情况，为Ag NPs的毒理研究奠定了基础。

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