河道水体黑臭前后微生物种群变化研究

王鹏 刘梅 翁益松 郑海宏 孙静亚

摘要 [目的]探究河道水体黑臭前后微生物群落的变化，为河道水体黑臭机制研究提供依据。 [方法]对河道水体黑臭前、黑臭中、黑臭后的水质进行高通量测序，进行微生物多样性分析。[结果]微生物多样性分析结果表明，确定水中引起黑臭变化的硫酸盐还原菌优势属种为狭义梭菌属严格芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、甲苯单胞菌属、伯克氏菌属、马赛菌属等优势种群，并得出关键致黑致臭微生物种群Clostridium sensu stricto 1，这一菌种在黑臭水体中的数量约20 000 cell/mL以上，占比64.09%，为黑臭核心微生物种，致黑臭微生物种群Clostridium sensu stricto 1为狭义梭菌属严格芽孢杆菌属类，具有硫酸盐还原功能，是主要的硫酸盐还原菌种群。[结论]硫酸盐还原菌Clostridium sensu stricto 1在河道黑臭过程中起到关键作用。

关键词 河道水体;黑臭;微生物多样性;硫酸盐还原菌

中图分类号 X172文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）22-0047-05

Abstract [Objective]The research aimed to explore the changes of microbial community before and after the black and odorous in river water， and to provide the basis for the study on the mechanism of black and odorous in river water. [Method] High flux sequencing and microbial diversity analysis were carried out on the water quality of the river water before， in and after the black and odorous. [Result]The results of microbial diversity analysis indicated that the dominant species of sulfatereducing bacteria that determined the change of black odorous in water were Clostridium narrowly strict bacillus， Clostridium perfringens，Toluenomonas， Burkholderia and Massilia.And the key black odorcausing microbial population Clostridium sensu stricto 1 was derived，the amount of this strain in black odorous water was about 20，000 cells/mL or more， accounting for 64.09%， which was a black odor core microbial species， and the black odorous microbial population Clostridium sensu stricto 1 was Clostridium narrowly strict bacillus. It had a sulfate reducing function and was the main sulfate reducing bacteria population.[Conclusion] Sulfatereducing bacteria Clostridium sensu stricto 1 plays a key role in the black and odorous process of river.

Key words River water body; Black odorous;Microbial diversity;Sulfatereducing bacteria （SRB）

硫酸鹽还原菌是一种典型的厌氧微生物，通常简称SRB，一般存在于地下、土壤、黑臭河道水体等缺氧环境中，硫酸盐还原菌的主要作用就是能够还原硫酸盐和亚硫酸盐，产生H2S[1-2]。

硫酸盐还原菌所具有的硫酸盐还原功能是导致其细菌所在的水体环境或其他厌氧环境产生黑臭的主要原因之一，它利用各种有机物为电子供体，使硫酸盐作为电子受体，在厌氧硫酸盐还原过程中，持续消耗有机物，使之持续性为硫酸盐、硫酸根离子或其他含硫物质离子提供电子，还原硫酸根离子、亚硫酸根离子产生硫化氢、硫脒等一类含硫物质[3-4]，使硫酸盐还原菌所存在环境恶臭，并在同步还原过程中使环境中存在的致黑因子如铁锰等离子还原为低价离子，如硫化亚铁与硫化锰等，使所存在的环境变黑。该研究通过分析河道水体在黑臭过程中微生物种群的变化，揭示硫酸盐还原菌在水体黑臭中的作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料 黑臭河水底泥选自于某城市已发生黑臭的河道底泥，祛除可见不同类杂质后冷藏保存。培养基选用硫酸盐选择性培养基（Postgate培养基）。

1.2 试验方法

1.2.1 微生物取样。为探究黑臭过程水中微生物多样性的变化，将河水按照5%体积比接种污泥，取3组样品进行分析。第1组为黑臭前，第2组为黑臭中，是培养3 d后取样，第3组为黑臭后，是培养7 d后取样。

1.2.2 测序流程。Illumina测序的内容包括基因组DNA[5]提取，设计并合成引物接头，PCR扩增及产物纯化，PCR产物定量和均一化，Illumina PE 300文库制备，Illumina 高通量测序[6]。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA[7]。

1.2.3 基因组DNA抽提、PCR扩增。将3组样品利用OmegaBioket公司的D5625-Soil-DNA试剂盒完成基因组DNA提取[8]，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，随后送至上海元莘生物公司进行DNA文库构建，采用PE250测序平台完成Illumina测序，测序区域为515F-907R，PCR扩增所用正向引物为515F：5′- GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，反向引物为907R：5′- CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′;全部样本按照正式试验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱;2%琼脂糖电泳检测[9]。

PCR 采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系：5×FastPfu Buffer 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，Forward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，补ddH2O 至 20 μL。

PCR 反应参数：a.1×（5 minutes at 95 ℃），b.27×（30 seconds at 95 ℃;30 seconds at 55 ℃;45 seconds at 72 ℃），c.10 minutes at 72 ℃，10 ℃ until halted by user。

1.2.4 荧光定量。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）[10]进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.2.5 生物信息分析。OTU聚类是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志[11]。OTU聚类（operational taxonomic units）使用：Usearch vsesion 7.1（http：//drive5.com/uparse/）软件平台对测序结果进行修剪、筛选、匹配和分析。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常对在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析[11]。

分析步骤如下：

对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量，去除没有重复的单序列，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格[11]。

2 結果与分析

2.1 PCR扩增结果鉴定胶图

从图1可以看出，样品（Lane 1-3）在500 bp大小处有一条明亮的带，与目的基因的大小一致，表明目的基因可能成功扩增得到。后续的测序结果表明，该500 bp大小处片段的序列与目的基因的序列一致，表明目的基因成功扩增（重组质粒成功构建）。

2.2 多样性分析结果

多样性分析结果中（表1），各指数表现相似性水平为0.97，样品有效，黑臭前OTU数值（486）与黑臭中OTU数值（678）差别较大，黑臭中样品丰度大于黑臭前样品，原因推测在黑臭产生过程中有同源相似性微生物大量繁殖。

2.3 PCoA分析

PCoA分析，即主坐标分析（principal co-ordinates analysis），也是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或差异性[10]。黑臭中的样品群落结构组成基于79.85%的变异系数与其他2个样品显著不同，黑臭前与黑臭后样品基于PC2（20.15%）分离，3个样品微生物菌落组成存在差异性。

2.4 群落结构组成

水体黑臭3个阶段的样品经过预试验后确认PCR产物目的条带大小正确，浓度合适[5]，可进行后续微生物多样性测序试验;以门、纲、目、科、属5个水平的群落组成[10-11]如表2所示。

如图3所示，黑臭前优势门Proteobacteria占比95.7%，在样品中为主要微生物群落，但在黑臭暴发期间，微生物Proteobacteria大量减少，微生物Firmicutes成为优势门，占比74.3%，在黑臭之后，Proteobacteria逐渐升高成为优势门，可知在整个黑臭时间段内，Firmicutes门先升高后逐渐减少，那么Firmicutes是影响黑臭的关键门，属类水平中可以发现，在黑臭前Pseudomonas的占比为77.81%，但在黑臭暴发期间，Clostridium sensustricto 1属成为优势属，占比64.09%，在黑臭后，Clostridium sensu stricto 1属减少，可知在黑臭期间关键微生物属为Clostridium sensu stricto 1（严格厌氧芽孢杆菌属1）。

2.5 核心基因组Heatmap分析

Heatmap是用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息[12]，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行物种或样本间丰度相似性聚类，将聚类后数据表示在Heatmap图上，可将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性[11]。图4所示，对比黑臭期间3个不同阶段，黑臭中阶段的微生物Clostridium sensu stricto 1、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Tolumonas、Massilia等大量繁殖，在热图中显示明显，在黑臭前显示不明显，为劣势微生物属，但在水体发生黑臭时，这几类微生物属大量繁殖，在热图所示黑臭中其百分比明显，为优势微生物属，但在黑臭后除Tolumonas（甲苯单胞菌属）外，其他优势菌属逐渐凋亡。

2.6 核心微生物菌种

如表3所示，黑臭暴发期间关键优势微生物属种Clostridium sensu stricto 1在黑臭中的数量约20 000以上，占比64.09%，Fuchs等[13]在探究产气荚膜梭菌对产生硫化氢的研究中提到Clostridium sensu stricto属的产气荚膜梭菌能够还原硫酸根离子产生H2S气体。Takahashi等[14]在硫酸盐还原富集培养物分离得到的梭状芽孢杆菌证明了狭义梭菌属为硫酸盐还原菌，Laishley等[15]在研究亚硫酸盐还原中提到狭义梭菌属能还原亚硫酸盐产生含硫气体等。Achá等[16]在探究大型植物外菌株汞甲基化和硫化氢中提到了甲苯单胞菌属（Tolumonas）能够还原硫酸根离子产生H2S;Giri等[17]与Kumar等[18]在研究挥发性有机硫化物与伯克氏菌相互关系时证明Burkholderia菌属有硫酸盐还原并产生含硫气体的功能。

2.7 系统发育树

系统发育树[19]在生物学中用来表示物种之间的进化关系。在进化树上每个叶子结点代表一个物种，如果每一条边都被赋予一个适当的权值，那么2个叶子结点之间的最短距离就可以表示相应的2个物种之间的差异程度[20]。如图5所示优势种群系统发育进化树中12个菌种来源于核心优势属类，抽取各种群菌种关键基因序列构建进化树，菌株Tolumonas osonensis strain OCF 7与菌株Aeromonadaceae bacterium 130I2自比值在95以上，可以证明这2株菌可能是一个祖先进化而来，存在相同的基因功能，同理Bacterium H4与Tolumonas auensis strain DSM 9187亲缘度较高，存在相同的基因功能。Burkholderia与Massilia菌类亲缘度同样较高，存在相同的基因功能。Clostridiales bacterium AU537，Clostridium beijerinckii NRRL B-598同样存在相同基因功能。

3 结论与讨论

河道黑臭过程中微生物多样性分析表明，产生黑臭的硫酸盐还原菌具体的属种为狭义梭菌属严格芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、甲苯单胞菌属、伯克氏菌属、马赛菌属等优势种群，并得出关键致黑致臭微生物种群Clostridium sensu stricto 1，这一菌种在黑臭水体中的数量约20 000 cell/mL以上，占比64.09%，为黑臭核心微生物种。

致黑臭微生物种群Clostridium sensu stricto 1为狭义梭菌属严格芽孢杆菌属类，具有硫酸盐还原功能，利用水体中的硫化物充当电子受体，通过还原硫化物产生硫化氢等致臭物质，还原过程中产生的S2-与自然水体中存在的Fe2+、Mn2+生成FeS、MnS，这一类含硫物质是关键的水体黑化污染物。对致河道水体发生黑臭变化的关键微生物种群进行研究为探究河道黑臭原因分析与河道黑臭治理提供理论基础。

参考文献

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[6] 李彤彤，李爱华.应用高通量测序技术比较三种不同鱼肠道微生物的群落结构[C]//中国水产学会鱼病专业委员会2013年学术研讨会论文摘要汇编.海口：海南大学海洋学院，2013.

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