不同波长LED光源对生物体离体细胞活性与形态影响的实验研究

（金陵科技学院，南京 210000）

1 引言

21世纪以来，智能化的设备改变了人们的传统生活方式，各式各样的智能手机、平板，电脑、液晶电视不断涌现，给人们的生活和工作带来极大的便利。但是在人们使用智能设备的液晶屏幕时，蓝光对人眼的危害也在同时进行。除了智能设备终端，随处可见的LED液晶屏幕也是有害蓝光的主要来源之一。液晶显示屏采用的都是LED背光，由于背光需要白光的效果，所以通常使用蓝色LED混合黄色荧光粉来形成白光。蓝色LED是一个主体硬件，因此这种白光中的蓝色光谱就拥有一个波峰。成年人眼晶状体虽然对蓝光具有较低的透过率，但长时间暴露在蓝光下仍然会造成视网膜的退行性改变，形成光致视网膜炎。

有研究灯光与照明系统的学者将光源对人体的危害进行了4级分类，分别为无危险级别，低危险级别（1类），中危险级别（2类）和高危险级别（3类），分类的主要依据是光源的辐射亮度以及人体产生不适感觉的主观程度，但对于不同波长的光源辐射以及辐射不同时间下的生物组织状态变化则研究较少。本文采用LED光照射生物体离体培养的细胞，控制使用不同波长的光源和不同的照射时间，来研究辐射参数对人体离体细胞的活性与形态的变化，通过分析实验数据，对人体离体细胞受光辐射危害的程度做出判断。

2 材料与方法

2.1 材料

研究中为了确定不同波长的光对细胞的影响，选择光源分别为紫光LED，其主要波长范围为395nm～400nm；蓝光LED，其主要波长范围为450nm～460nm；红光LED，其主要波长范围为620nm～630nm；以及白光LED，其输出功率相同，均为4.5W。而实验对象则选择细胞为人体离体细胞，其原因为选用活体细胞则可能由于自身代谢较快而对结果产生较大影响，导致结论的不准确。

2.2 方法

细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标，如药物处理、放射或紫外线照射、培养条件变化等，它是从事相关方面的科学研究的常用手段，更是体外筛选抗肿瘤药物和临床肿瘤药敏试验的重要方法之一。目前常用的方法很多，如有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素渗入法、MTT法、CCK-8法等。

当使用MTT法测试细胞活性时，需要使用裂解液溶解甲赞晶体沉淀，可能遇到颗粒不完全溶解以及在吸取上清的操作中也极易带走部分细胞等问题，导致了MTT法的检测稳定性不佳，对于重复性实验，结果容易出现较大差异。为了实验的操作方便以及实验的准确度，本研究选择了CCK-8法。CCK-8法使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂，能快速检测，检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度，重复性优于MTT 法，对细胞毒性小，另外，CCK-8法中的细胞活性检测试剂为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

CCK-8检测细胞活性的原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8[化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye），生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，便可检测出待测细胞样品的活性。

细胞活性测定

（1）当细胞贴壁生长密度达到80-90%后，弃掉培养基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等体积培养基吹打细胞，离心分离，再加入新培养基。

（2）调节细胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接种100ul细胞悬浮液，培养24小时。

（3）弃掉培养基，加新培养基100ul/孔，分别用4种不同光源（紫光、蓝光、红光、白光）对细胞分别进行光照1小时和2小时

（4）向每孔加入10ul CCK-8溶液，培养箱孵化1-4小时。

（5）用酶标仪分别测定1小时和2小时在450nm处的吸光度。

细胞形态测量

（1）当细胞贴壁生长密度达到80-90%后，弃掉培养基，加入PBS系三次，加入2ml胰酶消化5min，加入同等体积培养基吹打细胞，离心分离，再加入新培养基。

（2）调节细胞密度到5×104/ml，于96孔板，每孔接种100ul细胞悬浮液，培养24小时。

（3）在未有光源照射时，先观察每组细胞形态变化。

（4）再分别用4种不同光源（紫光、蓝光、红光、白光）对细胞分别进行光照1小时和2小时，在显微镜下观察相同时间下每组细胞的形态变化。主要观察细胞表面的形态是否规整，细胞的边缘是否光滑，细胞的碎片是否很多，是否有细胞由黑点变成了亮点。

3 结果与分析

3.1 光辐射对细胞活性的影响

在细胞受光辐射之前测得其平均吸光度为0.1602875，再分别用紫光、蓝光、红光、白光LED照射细胞，测得1h和2h时的细胞吸光度。在1h时测得的细胞吸光度与未受光辐射时没有明显变化，而细胞受光辐射2h后测得的数据如下表：

表1 细胞受不同波长LED光照射2h后的吸光度平均值和方差表（单位：吸光度）

生物体细胞在受紫光LED照射2h后，吸光度下降较大，并且方差是所有结果中最高的，表明紫光照射对细胞产生了较为显著且强烈波动的影响；而蓝光照射2h后，细胞吸光度下降程度最高，表明该种波长的光与生物体作用最明显，蓝光产生的光化反应最多；红光LED照射2h后，细胞的平均吸光度有所上升，表明该波长的光对细胞产生了一定程度的促进作用，使得吸光物质含量上升；白光的效果与蓝光较为接近，但方差较小，表明了白光LED中具有与蓝光接近的成分，但影响程度较为均衡。

对以上数据进行对比分析，可以得到以下结论：根据2h时的测得的细胞吸光度数据的方差，可以看出：蓝光、红光和白光对应的数据集中度相对较高，表明蓝光、红光和白光对细胞的影响程度比较均匀，而紫光对应的数据集中度相对较低，表明紫光对细胞的影响程度差异性较大。根据2h时测得的细胞吸光度数据的平均值，可以看出细胞在经过2h的不同波长光的照射情况下，蓝光照射2h后的细胞所测得的细胞吸光度在四种光对细胞照射2h后测得的吸光度中数值最低，蓝光对细胞的活性的影响最大，会使细胞活性处于最低的状态，即蓝光对细胞的危害程度最高。

3.2 细胞形态的分析

在细胞受光辐射之前拍摄其形态，再分别用紫光、蓝光、红光、白光LED照射细胞，用显微镜记录受照射1h和2h后的细胞形态。结果显示，光辐射1h后拍摄的细胞形态与未照射时几乎无变化，而受光照射2h后拍摄的的细胞形态则出现较为明显的变化，结果如下图所示。

图3 细胞受不同波长LED光辐射前后形态图

图中，（a）为人体离体细胞未受光辐射时形态图，（b）（c）（d）（e）分别对应紫光、蓝光、红光、白光LED光辐射2h后的细胞形态。

对于以上的细胞形态图片的分析，未照射时，细胞的形态比较规整，细胞的边缘很光滑，细胞碎片不多。在受紫光、蓝光、红光和白光LED照射2h后，出现了与初始状态较大的变化。其中受蓝光照射2h后的细胞形态已经模糊，细胞的基本外形已消失，细胞碎片较多，而在受紫光和白光照射2h后的细胞中，有少许形态模糊的细胞和少许细胞碎片，红光照射2h时的细胞中，细胞边缘有变形，整体情况稍好。由此可见，在选择的四种光中，蓝光对细胞形态的损害最为严重，即蓝光辐射对细胞的危害程度最高。

生物组织与常规光学介质不同，因为其内部结构非常复杂，包含了大量不同体积，不同种类的细胞，而每一种细胞的细胞膜，细胞质，细胞核的大小形状也不同，所以对光的折射、反射以及吸收效果也就各不相同。吸收是影响光在生物组织内传播的主要物理现象之一，通过吸收效应，生物组织可以将光能量转化为其他形式的能量，比如分子的动能、其他波长的荧光辐射能量等，进而影响到组织中的细胞与分子基团，导致生物体生理状态的改变。在本的研究结果中，对于蓝光产生最大影响的原因是长时间过量的蓝光辐射会导致细胞中活性氧水平快速上升，进而引发一系列的代谢过程，其部分中间产物导致了细胞凋亡，对细胞和组织造成杀伤，从而造成不可逆的损伤，体现出细胞活性的下降与形态的变化。

4 结束语

本研究通过使用紫光、蓝光、红光、白光等不同波长的LED对人体离体细胞进行相同时间的辐射，选择细胞的活性和形态作为参数进行研究与分析，从而对人体离体细胞受蓝光危害的程度做出判断。在进行1h照射时，细胞的活性与形态均变化不明显，可以证明，人体在受光辐射不长时间内产生的影响可以通过自身的调节而消除；而在2h照射后，蓝光照射后的细胞吸光度处于最低的状态，而其他波长的光也都产生程度不等的影响，也即长时间的光辐射均为产生细胞损伤，而蓝光对细胞活性的影响最大；，通过对细胞形态的观察也可以证明，长时间的光辐射均可以得细胞形态发生较大的变化，也同样是蓝光对细胞形态的影响最为显著。