黑叶不结球白菜耐热性的抗氧化指标评估体系的构建

赵思涵，田丽波，商 桑，杨 衍，邹凯茜，曾丽萍，刘子记，刘昭华

(1.海南大学 园艺学院/海南省热带园艺作物品质调控重点实验室，海口 570228；2.海南大学 生命科学与药学院，海口 570228；3.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点开放实验室，海南儋州 571737)

利用热害指数进行耐热性鉴定，过程复杂漫长，试验过程中容易受到各种主观、客观因素影响，造成结果不够准确。胡俏强等[7]对普通白菜进行37℃/27℃高温处理，在前3d各品种间热害指数差异不显著，无法区分耐热品种，到第7天可区分部分热敏与耐热品种，对普通白菜只进行高温处理耐热性强弱难以区分。植物的耐热性是多基因控制的数量性状，高温胁迫下会涉及多个生理生化变化，可引起植物膜脂过氧化作用，导致植物细胞破坏或细胞死亡，植物内源保护系统的抗氧化能力及生物膜的稳定性对植物逆境胁迫响应至关重要[8]。采用单一指标，不足以反映出植物的耐热性差异，根据植物对热胁迫的抗氧化指标的响应结合多元统计分析可对植物耐热性进行全面准确的评价。

近年来，已有多篇文章利用多元统计分析法对植物生物胁迫和非生物胁迫抗性进行综合评价，该方法已得到广泛应用，如在黄瓜[8]、万寿菊[9]、大豆[10]、棉花[11]等植物抗逆性鉴定表现优良。本试验以13个黑叶不结球白菜品种为试材，测定37℃/27℃高温胁迫下黑叶不结球白菜的12个抗氧化指标，运用多元统计方法，分析各影响因素的作用及相互之间的关系，构建黑叶不结球白菜耐热性抗氧化指标评估体系，对黑叶不结球白菜主要栽培品种的耐热性强弱进行分类，使黑叶不结球白菜耐热性鉴定直观、简便和准确，为耐热黑叶不结球白菜品种选育、鉴定耐热品种的遗传多样性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试黑叶不结球白菜品种13份购于各种子公司，见表1。

1.2 试验方法

1.2.1 培育幼苗及温度处理 选取饱满、整齐一致的种子，温汤浸种，20 ℃下催芽，60%露白时播种于50孔育苗穴盘，一穴一粒。两片子叶展开后移栽至8 cm×10 cm黑色育苗钵。基质配方是体积比1∶1∶1的泥炭、蛭石和珍珠岩，常规管理。当幼苗长至4～5片真叶时，在人工气候箱中预处理2 d，温度为25 ℃/18 ℃，光强为300 μmol /(m2·s)、光周期为昼夜12 h /12 h，相对湿度控制在70%～80%。然后进行高温胁迫 37 ℃/27 ℃处理，高温处理5 d，对照处理为 25 ℃/18 ℃，其余条件同上。每个处理3次重复，每次重复18株，随机区组排列。处理5 d后，测定各项形态及抗氧化指标。

表1 供试的黑叶不结球白菜品种Table 1 Non-heading Chinese cabbage varieties tested

1.2.2 测定项目及方法 热害指数(Heat injury index,HII)的测定参考2014江苏省耐热小白菜鉴定实施标准[4]、刘维信等[6]和胡俏强等[7]的方法，略有改动，每天进行观察，根据叶片反卷及褪绿，确定分级标准。热害指数小则材料耐热性强。

热害指数=∑(各级株数×级数)/(最高级 数×调查总株数)×100%

1.2.3 数据统计分析 除热害指数外，对其他12个指标计算耐热系数。用 SAS 9.2 软件对所有指标进行多元线性相关性分析、多元逐步线性回归分析、隶属函数分析、主成分分析和多元聚类分析。隶属函数分析依照模糊数学中隶属函数的方法[12]。用 Excel 2010软件对所得数据进行 整理。

本文探讨了环偶极子超材料的研究和发展现状，环偶极子独特电磁特性能与太赫兹波特性相结合，必产生一系列独特的物理现象。太赫兹频段环偶极子超材料可以缓解太赫兹波段器件缺少的现象，可实现对太赫兹波进行调控、滤波、开关和延时等操控，可用于制备传感器、调节器、切伦科夫计数器等太赫兹先进器件。

耐热系数=处理测定值/对照测定值

各综合指标隶属函数值：μ(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)j=1,2,…,n

各综合指标的权重：Wj=Pj/∑Pjj=1,2,…,n

综合耐热评价：D=∑[μ(Xj)×Wj]j=1,2,…,n

式中，Xj表示第j个综合指标；Xmin表示第j个综合指标的最小值；Xmax表示第j个综合指标的最大值。Wj表示第j个综合指标在所有指标中的重要程度即权重；Pj为各自交系第j个综合指标的贡献率。D值表示各高代自交系在高温胁迫下由综合指标评价所得的耐热性综合评价值。对D值进行聚类分析，并对D值与耐热系数进行逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 黑叶不结球白菜各指标的方差分析和相关性分析

由表2可知，黑叶不结球白菜品种经高温处理后，其APX、GR、MDA、ASA、PAL、PPO、POD、SOD、CAT的耐热系数平均值均大于1，说明高温胁迫对上述9个指标均呈正向效应。除APX、POD外其余指标均表现出显著差异(P<0.05)或极显著差异(P<0.01)，说明本试验中的黑叶不结球白菜品种在耐热性上具有很好的遗传多样性，这11个指标都可以作为黑叶不结球白菜耐热性评价的辅助指标。

表2 高温胁迫下13个黑叶不结球白菜品种耐热系数及各指标多元方差分析Table 2 Heat resistance coefficient of 13 black leaf non-heading Chinese cabbage varieties under high temperature stress and various indexes of multivariate analysis of variance

注：*、**代表不同品种的某个性状在0.05或0.01水平具有显著性差异,下表同。

Note: *,** represents significant difference of certain trait at 0.05 or 0.01 level,the same below.

对各品种的13项指标进行相关分析得出相关系数矩阵。从表3可以看出，13个品种的部分生理指标之间存在不同程度相关性，使得各指标间提供的信息存在着明显的重叠。其中GSH与AsA呈极显著正相关，GSH、AsA与MDA和GR呈显著正相关，AsA、PAL与PPO呈显著负相关，APX与H2O2和 呈显著负相关， 与H2O2呈显著正相关， 与CAT呈显著正相关，PAL与POD呈极显著负相关，与PPO呈显著负相关，H2O2、SOD与热害指数呈显著负相关，说明在高温胁迫下，黑叶不结球白菜的各抗氧化指标之间存在一定的协同性和拮抗性，抗氧化酶和抗氧化物质协同清除 ，避免H2O2的过量积累，从而减少高温胁迫对膜系统的伤害。不同指标在热胁迫下反应不同，说明不结球白菜的耐热性较为复杂，单项指标难以准确客观地反映不结球白菜品种对高温的耐热性差异，因此，构建复合指标评估体系，采用多元统计分析方法对各指标进行综合评价以弥补单项指标鉴定的局限性是非常有必 要的。

表3 黑叶不结球白菜各指标间的相关系数矩阵Table 3 Correlation coefficient matrix of different indexes about black leaf non-heading Chinese cabbage

注：*、**代表各指标在0.05或0.01水平上的相关性。

Note: *,** represents significant correlate at 0.05 and 0.01 level.

2.2 主成分分析

通过计算各抗氧化指标的耐热系数与主因子系数，得到每个品种的4个主因子得分值。说明该品种在这一主因子上的耐热性强则CI值大，反之耐热性弱。由表5可以看出，B12和B1在主因子1上的耐热性最强，B8主因子2 上的耐热性最强，B20在主子3上的耐热性最强，B21在主因子4上的耐热性最强。

2.3 隶属函数分析

利用主因子贡献率计算各主因子的权重(Wj)。由表6可以看出，主因子1的权重最大。在黑叶不结球白菜耐热性评价中4个主因子的作用不同，将CI(j)值利用隶属函数法进行转换，得到各品种的隶属函数值μ(j)和综合评价值(D)，根据D值评价各品种的耐热性。13个黑叶不结球白菜品种的耐热性强弱依次为:B12>B14>B19>B1>B16>B2>B21>B18>B8>B10> B9>B20>B15。

2.4 聚类分析

采用系统聚类(Hierarchical clustering ) 中的最长距离法(Furthest neighbor) ，以欧氏距离(Euclidean distance) 为遗传距离进行聚类分析，结果见图 1，在欧式距离为0.73时，可划分为4类。第Ⅰ类(强耐热品种)包括3个品种，B12、B14、和B19，第Ⅱ类(耐热品种)包括3个品种，B16、B2和B1，第Ⅲ类(不耐热品种)包括4个品种，B21、B18、B8和B10，第Ⅳ类(热敏感品种)包括3个品种，B9、B20和B15。

表4 各综合指标的系数及贡献率Table 4 Coefficients of comprehensive indexes and proportion

表5 13个黑叶不结球白菜的4个主因子得分值Table 5 Scores of main four factors of black leaf non-heading Chinese cabbage

2.5 综合评价及分类

分析13个参评性状与不同品种之间的耐热性关系，筛选能够客观鉴定黑叶不结球白菜耐热性的指标，建立数学模型用于黑叶不结球白菜种质耐热性评价，将耐热性综合评价值(D值) 作为因变量，各单项指标的耐热性数据作为自变量进行逐步回归分析，建立最优回归方程D= 0.019 76+0.623 98AsA+0.152 92H2O2- 0.142 79SOD-0.214 34PPO，方程决定系数R2=0.925 4，P< 0.000 1。由此方程可知，13个参评性状中有4个性状对黑叶不结球白菜耐热性的鉴定有显著性影响，分别是抗坏血酸过氧化物酶活性、过氧化氢、超氧化物歧化酶、多酚氧化酶。

3 讨论与结论

植物耐热性受多种因素影响，需要综合多项指标分析各品种间的耐热性。多元统计方法将高维问题转换成低维问题加以处理，使定量评价、鉴定变得相对简单、直观，并通过有效分类方法将评价对象定性划分成不同类别[14]。其中主成分分析方法解决了综合变量覆盖和降维问题，将多个指标转化为综合指标，仍然可以尽量反映原来变量的信息量。本试验采用多元统计分析方法包括方差分析、相关性分析、主成分分析、聚类分析实现了数据对象集合的聚类归约，使结果更为科学合理[5,12]。

在高温胁迫条件下，植物受到伤害主要是细胞产生的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)导致生物膜过氧化作用[15-18]。植物细胞内保护酶(SOD、POD、CAT、APX)和抗氧化物质(AsA、GSH)在高温下形成植物酶促防御系统，整体含量先增加后降低，个别指标表现为持续性连续下降的变化[18-22]。PPO作为内源呼吸酶在植物氧化酶系中，与植物的代谢强度及环境胁迫密切相关。叶陈亮等[23]对大白菜的研究表明，耐热性强的品种SOD活性高于耐热性弱的品种。在高温胁迫过程中诱发植物细胞内以H2O2为代表的活性氧水平的增加而导致氧化胁迫[22-25]。在本试验中SOD与热害指数呈显著负相关， 与H2O2呈显著正相关与在大白菜上的研究结果相似。作为植物抗氧化剂的AsA，可直接清除羟基自由基、超氧自由基，通过 AsA-GSH循环，精密调控植物细胞中的 H2O2等，AsA-GSH循环控制在细胞可行使信号传导的和逆境胁迫应答及适应的生理水平[26-29]，本试验中GSH与AsA呈极显著正相关，GSH、AsA与MDA和GR呈显著正相关。本试验研究结果表明，高温胁迫下黑叶不结球白菜MDA 含量增加，说明高温胁迫使黑叶不结球白菜细胞膜脂过氧化作用增强，SOD、POD活性呈升高的变化趋势，AsA含量总体也呈上升趋势，说明高温胁迫下黑叶不结球白菜可通过提高SOD和POD酶的活性来清除自由基，起到一定的抗氧化保护作用，ASA可增强黑叶不结球白菜的抗氧化胁迫能力，它们构成了黑叶不结球白菜适应高温逆境的重要物质基础。即SOD、POD、PPO和H2O2与黑叶不结球白菜的耐热性有一定的关系[30-32]。

表6 13个品种隶属函数μ(j)值和耐热排名Table 6 Value of membership function μ(j) of 13 varieties and ranking of heat-tolerance

图1 13份黑叶不结球白菜种质耐热性的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of heat tolerance of 13 black cabbage non-heading Chinese cabbage

研究高温胁迫下植物抗氧化指标的响应，挖掘与耐热性相关的鉴定指标，构建黑叶不结球白菜耐热性抗氧化指标评估体系，对黑叶不结球白菜耐热性品种选育和为生产推荐优良品种具有重要意义。本研究通过多元统计分析，最终发现编号为B12的“中脚葵扇黑叶匙羹白”、编号为B14的“玉兔杂交黑叶白菜”和编号为B19的“北京黑叶白”，在13个黑叶不结球白菜品种中的耐热性最好，综合性状表现较优，与田间观察结果基本一致，但在各品种的耐热排序上不完全相同，所以采用多元分析方法综合鉴定，避免淘汰耐热优良 品种。