SSR和ISSR法对白芨的真伪鉴定①

2019-12-10邢佳鑫张敦宇李维蛟

热带农业科学 2019年10期

邢佳鑫陈玲张希张敦宇李维蛟③

(1云南农业大学农学与生物技术学院云南昆明650201;2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室云南昆明650205;3云南中医药大学云南昆明650500)

白芨（Bletilla striata）是兰科多年生草本地生植物，生长在海拔100～3 200 m的常绿阔叶林下，栎树林、路边草或岩石缝中，是珍贵的药用植物，具有收敛止血、清热解毒、抗菌、抗肿瘤、消肿生肌的功能。白芨胶可作为天然高分子药物成膜材料、助悬剂和天然的药物乳化剂［1-4］。近年来，市场对白芨的需求量在不断上升，但白芨种子在自然状况下很难萌发和生长，因此白芨组培苗成为当前人工栽培的主要种苗来源［5］。由于近年来正品药材短缺难以满足市场需求，民间常用其他类似品种取而代之，代用品、习用品的随意使用使得中药材品种复杂混乱的情势加剧。随着白芨组织培养及育苗技术的发展，白芨的伪品也越来越多，因此白芨组培苗的真伪鉴定逐渐成为市场需求的重要技术。

苏钛等发现，滇产白芨、小白芨、黄花白芨在植物形态、药材性状、显微特征方面都高度相似，在分类学上特征差异亦较小［6］；陈美君等［7］对白芨和黄花白芨的化学成分进行分析比较，发现白芨和黄花白芨所含化学成分也很相似，难以鉴别。因此利用感官评价、显微鉴定和理化鉴定等中药鉴定技术［8］难以鉴别出真正的白芨苗。近些年来，分子标记技术在药用植物鉴别研究中已有广泛应用，具有特异性强、稳定性高、快速、微量，不受生长发育阶段、器官组织差异、环境条件影响等优势，它给现代药用植物的鉴别研究注入了新的活力，开辟了新的道路，虽尚处于资料积累阶段，但可预见其具有巨大的应用潜力，可推动中药材的现代化研究进程［9-10］。《中国药典》2010年版已将蕲蛇和乌梢蛇的分子鉴定作为评价指标［11］。其中SSR和ISSR具有独特的优势，具有操作简单、多态性丰富、重复性强、实验稳定性好、模板用量少和试验成本低等优点，不仅可用于不同产地药用植物资源的划分，同样也可用于物种的鉴定与划分，为育种工作奠定基础。Safaei等［12-14］利用ISSR分子标记对6个丹参种的39个植物样本进行研究，结果表明该技术能应用于形态学研究中的物种鉴定与划分。

本研究通过选用SSR引物和ISSR引物，应用分子标记技术对外观较相似的白芨组培苗与正品紫花白芨组培苗样品进行遗传多样性分析，成功构建了利用SSR和ISSR分子标记技术快速鉴定白芨组培苗真伪的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

白芨样品：1份正品紫花白芨组培苗，实验室内培育，编号为1号；7份外观较相似的白芨组培苗，于市场上购买得到，分别编为2～8号。

1.2 方法

1.2.1 白芨DNA的提取

采用改进的CTAB法［15］提取白芨的基因组DNA，即取约0.1 g样品叶片，放入2 mL EP管内，再放入经酒精消毒过的直径为5 mm的小钢珠，写好编号，放在方形的EP管盒内，向盒内倒入液氮，速冻叶片，倒出液氮，盖上盒盖，上下快速震荡，使小钢珠充分研磨叶片；加入400 μL含有2%（V/V）β-疏基乙醇的CTAB缓冲液，温和混匀；65℃温浴30～60 min，每隔一段时间振动一次离心管，使其充分混匀，受热均匀；用等体积（400 μL）的氯仿/异戊醇（24∶1）抽提匀浆液，颠倒数次使其充分混匀，于18℃10 000 r/min离心10 min，吸取上清液到另一无菌的1.5 mL EP管中，加入等体积-20℃预冷30 min的异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置1 h；1 h后，于4℃ 10 000 r/min离心10 min沉淀DNA；弃上清液，加入适量（1 mL）75%乙醇洗涤沉淀，10 000 r/min，4℃，离心5 min；弃洗涤液，加入适量（1 mL）75%乙醇再次洗涤沉淀，10 000 r/min，4℃，离心5 min；于4℃ 10 000 r/min离心5 min，弃上清液，待DNA干燥后，用1×TE溶解，并用RNA酶除去RNA。总DNA采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质量，并用紫外分光光度计（Thermo Nano-Drop 2 000）检测DNA浓度，然后稀释至25 ng/μL用于SSR-PCR和ISSR-PCR反应。

1.2.2 SSR-PCR扩增

PCR反应体系共20 μL，其中DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6μL。PCR反应在PCR扩增仪（Biometro）上按以下程序运行，首先94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃复性45 s，72℃延伸45 s，35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。反应产物以MakerDL 1 000为分子量标准，取7 μL PCR产物用含GenGreen核酸染料的4%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像仪（Platinum HD7）下观察拍照。

1.2.3 ISSR-PCR扩增

PCR总反应体系为20 μL，包括DNA模板（25ng/μL）2 μL，2×Mix（天根生物科技）10 μL，正反引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应在PCR扩增仪（Biometro）上按以下程序运行，首先94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，40个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。反应产物以MakerDL1 000为分子量标准，取7 μL PCR产物用含GenGreen核酸染料的3%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外分光透射仪（Platinum HD7）下观察拍照。

1.2.4 引物合成

选用黎君等筛选出的20对白芨SSR引物（表1）［16］，和22对ISSR随机引物（表2），由上海生工公司合成。用20对SSR引物分别扩增1号正品白芨DNA，筛选出多态性丰富、主带明显的引物。

表1 SSR引物信息

表2 ISSR引物信息

1.2.5 数据分析与统计

用MakerDL 1 000作为分子量的标准，根据各扩增片段的迁移距离和大小，将SSR和ISSR扩增产物的电泳结果中稳定出现的条带的有或无分别进行赋值，在相同迁移位置，有带记为1，无带记为0，以“0，1”格式构成SSR和ISSR带型数据矩阵。利用Excel进行统计和整理。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

1份正品紫花白芨和7份组培苗的基因组DNA，在1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。所提取的DNA整齐，电泳条带清晰，未被蛋白质污染，也无降解，基因组DNA纯度较高。所提DNA的质量能满足后续PCR扩增反应。用紫外分光光度计在260和280 nm处测量吸光度A，进行DNA纯度、浓度计算。将所提DNA的浓度全部稀释为25 ng/μL，用于后续PCR扩增反应。

图1 8份材料的DNA电泳图

2.2 引物筛选

20对SSR引物扩增1号正品白芨DNA的电泳检测结果见图2。从中筛选出重复性好，多态性丰富，条带清晰的14对SSR引物，分别为Bjssr01、Bjssr03、 Bjssr04、 Bjssr05、 Bjssr06、Bjssr09、 Bjssr11、 Bjssr13、 Bjssr14、Bjssr17、 Bjssr19、 Bjssr22、 Bjssr23、Bjssr24。

图2 SSR引物筛选结果

2.3 样品差异性分析

部分SSR引物和部分ISSR引物对供试样品的扩增结果分别见图3。14对SSR引物中，发现有7对检测出部分供试样品之间带型存在差异（表3）。22对ISSR引物中，发现有21对检测出部分供试样品之间带型存在差异（表4）。其中，Bjssr03、Bjssr17和uBC808检测出4号和8号样品与1号标准品之间存在带型差异；Bjssr05、Bjssr011检测出4、5、6号和7号样品与1号标准品之间存在带型差异。Bjssr04、Bjssr14、Bjssr22、uBC811、uBC814、uBC815、uBC817、uBC818、uBC820和uBC823检测出4、5、6、7号和8号样品与1号标准品之间存在带型差异。

综上所述，筛选出的36对引物都未检测出2号和3号与1号标准品之间存在带型差异。根据不同的引物扩增结果，4、5、6、7号和8号样品与1号标准品之间存在带型差异。表明2号和3号为真的紫花白芨可能性较大，4、5、6、7号和8号为假的紫花白芨。

3 讨论

本研究采用了分子标记技术，从基因层面来鉴定白芨组培苗的真实性，解决了白芨真伪鉴定困难的问题，建立了更加精准，快捷的白芨鉴定的技术方法。共筛选出14对SSR引物和22对ISSR引物，其扩增结果多态性位点丰富，条带清晰可见，结果稳定，这些标记可作为白芨分子鉴定的依据。

近年来，SSR技术已成功应用于作物品种的真伪鉴定方面，ISSR分子标记技术也被广泛应用于道地药材的品质鉴定。杨双等［17］应用SSR技术建立了玉米品种沈玉21的DNA指纹图谱，成功鉴定了两份样品的真伪；黄成志等［18］利用SSR分子标记成功鉴定了水稻种子中优88、协优88和全丰优88的真伪和纯度，结果表明SSR分子标记鉴定和田间鉴定的结果基本上一致；周晔等［19］运用显微鉴定和ISSR技术鉴别中药玉竹（Polygonatum odoratum）及其掺伪品小玉竹（P.humile），结果显示通过ISSR标记可以将玉竹及其主要掺伪品区分开，同时，运用ISSR分子标记技术能有效的区分中药黄精（P.sibiricum）和卷叶黄精（P.cirrhifolium）［20］，保证了用药的安全；罗沛宜［21］通过筛选ISSR引物，找到了特异性的当归条带，能成功的对当归及其混伪品进行鉴别。然而，利用分子标记技术来鉴定白芨的真伪还未见报道。因此，本研究中建立的白芨分子鉴定体系具有重要的实用意义，为以后的白芨组培苗的分子鉴定提供了依据，可为白芨属植物资源的保护、利用和评价奠定良好基础。