木薯野生种与栽培种相互嫁接技术的研究①

鲍茹雪 张怀方 陈 新 邹枚伶 王文泉③

(1南京农业大学生命科学学院 江苏南京210095;2中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南海口571101)

木薯（Manihot esculentaCrantz）是大戟科属多年生木本作物，主要分布于非洲、东南亚和中南美洲地区。其块根产量高且富含淀粉，被誉为“淀粉之王”。最新资料显示，木薯已经成为全球第四大粮食作物［1］。木薯淀粉除可以直接用于食品和饲料添加外，经深加工后所得到的变性淀粉，在生物医药、造纸、纺织、建材和铸造等领域都有利用，已成为世界公认的利用价值极高的能源与经济作物。木薯抗旱性突出，耐贫瘠和酸性土壤及其高生物积累特性等优点，对于研究热带作物的基本生物学特性具有借鉴意义。

嫁接是一种古老的植物繁殖方式。在人工或自然条件下，通过“接穗”与“砧木”的连接，使嵌合体成长为完整植株，即为嫁接。而影响嫁接成活率的首要因素是品种间的亲和性，其中不亲和性随着遗传距离的增加而逐步变大［2］。嫁接材料自身的生理结构特性和生长活力是影响成活率的另一要素。木本植株，如核桃树完成维管束组织的修复需要几个月［3］，而草本植物，如拟南芥只需3天［4］。对于外部影响因素来说，嫁接方法、时间、温度等也随嫁接作物类型而变化。

一直以来，嫁接主要应用于提高作物产量、改良植株性状、减少土肥依赖［5-8］、增强植株抗逆性等方面［9-13］。许多研究者也对砧木与接穗相互作用的内在机制进行了深入研究［14-18］。嫁接技术在木薯育种工作中，主要致力于增强其对病虫害抗性、提高产量和研究内在机制等方面。在抗病虫害的研究中，利用具有病毒抗性的转基因木薯株系作为砧木进行嫁接，所得嵌合体植株显示出对木薯褐条病和木薯花叶病极高的抗性，并对产量的提升有一定帮助［19］。而另一项研究显示，感染褐条病的接穗可以通过嫁接感染整株木薯，因此选取优良性状的砧木与接穗对于生产实践至关重要［20］。2011 年， Bomfim 等［21］使 用木 薯品 种Manihot fortalezensis分别嫁接于木薯砧木UnB201和UnB122上，对块根进行解剖学分析，发现块根中柱鞘纤维和毒素等显著减少，而这些解剖结构的变化是由于遗传物质从接穗转移到砧木引起的。

木薯野生型为典型的C3植物，叶片（源器官）的CO2固定率和蔗糖合成率较高，地上部粗壮庞大，而其块根（库器官）只积累小部分碳水化合物［22］。但栽培型是一种介于C3和C4的中间型植物，具有高效光合速率和生物能量的储藏潜力。

本研究通过选取源与库存在极大差异的木薯种质资源：野生型木薯品种W14（Manihot esculentassp.Flabellifolia），栽培品种华南205（SC205）与KU50，获得盆栽苗后，通过野生木薯与栽培木薯的相互嫁接，对嫁接技术与嫁接条件进行优化，获得嫁接嵌合植株，为后续研究提供重要的研究材料。获得这种生理性嵌合体植株后，结合组学技术，可以深入研究木薯光合产物运输及块根形成的源与库交流信号，为揭示木薯高生物积累机理及育种工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试材

选用野生祖先亚种品系W14（Manihot esculentassp.flabellifolia）和栽培木薯品种KU50、华南205（SC205）做相互嫁接处理。W14引种自巴西，主要通过种子繁殖，其茎秆繁殖能力低下，结薯少且小，产量很低，块根中干物质含量一般在5.0%～8.0%；栽培品种KU50和SC205为东南亚和我国主栽品种，主要以茎秆繁殖为主，块根富含淀粉，产量高，干物质率35.0%～45.0%。所有试验材料取自海南省海口市澄迈县中国热带农业科学院热带生物技术研究所木薯试验基地。

1.2 方法

1.2.1 W14种子处理与种植

打磨W14种壁两侧至微露子叶，洗净，清水初筛后，选取活力较好的种子各50颗，分别浸泡于4种不同梯度的激素混合溶液中（NAA与GA3两者终浓度均分别为0.0、1.0、10.0、100.0 mg/L）。24 h后洗净，用多菌灵溶液浸泡30 min。蛭石和营养土按1∶3混合，倒入培养钵里，把种子埋入土中，加入清水，27℃左右，保持湿润。待种子发芽后，转移到20.0 cm×25.0 cm塑料花盆中，注意浇水及观察生长状况。

1.2.2 SC205与KU50种茎繁殖

土与沙子按3∶1比例混合，装于20.0 cm×25.0 cm的花盆中。收获的SC205与KU50茎秆，取10.0～12.0 cm作为种茎，保留3～4个芽点，直插入花盆中，每个品种30株，放于大棚中正常管理。

1.2.3 芽接

选取健壮、无病虫害的芽点，用手术刀自下横切处贴紧茎秆木质部向上削，形成下窄上宽的盾形芽片，即为接穗。在砧木光滑，健康部位，用手术刀切如“T”型。挑开砧木上“T”字形切口的皮层，将接穗直插入切口。插入接穗的上端切口与“T”字形横切口对齐，使用塑料薄膜自上往下从接口上端绑至下端，保证伤口抱紧，而芽点和叶柄留于外侧。每一种茎嫁接2～3个芽点，以保证其成活率。置于27℃左右的培养房中，暗培养24 h后，逐渐增加光照。在嫁接前3天湿度控制在90%以上，后逐渐降低湿度至正常。接后3～4 d可检查芽接是否成活。

1.2.4 劈接

嫁接前，向砧木和接穗均匀喷洒纯净水，直至叶片水分滴落为止。去除多余的叶片，用已消毒的嫁接刀将砧木去顶削平，从中间垂直下刀，劈开深至2.0～3.0 cm。选取生长势旺、健壮无病害的接穗约10.0 cm，将接穗下端两面对称斜切2.0～3.0 cm，形成楔形。接穗插入砧木时使两侧的形成层对准，用塑料薄膜包扎好接口。置于27℃左右的培养房中，暗培养24 h后，逐渐增加光照。在嫁接前三天湿度控制在90%以上，后逐渐降低湿度至正常。1周后，接穗部分皮色鲜绿，有一定的生长，则移出培养房，置于室外弱光下适应外界环境，并逐渐增加光照。40 d左右，移栽大田。

1.2.5 嫁接苗培养和管理

大田实践于热带生物技术研究所海南澄迈木薯试验基地进行。采用随机区组田间设计，小区面积15.0 m×3.0 m，每个品种9株，3次重复。试∶∶验地土质为红壤土。移栽前深翻30.0～40.0 cm，垄距60.0～70.0 cm，株距30.0～35.0 cm，深挖25.0 cm，用剪刀剪开塑料盆，带土移栽。统一抽水灌溉，随后进行正规的田间管理，观察长势。根据实际生长情况加深排水沟，除草，浇水肥，喷洒农药等。

2 结果与分析

2.1 W14种子处理与嫁接材料准备

野生祖先种W14种子在正常情况下不能出芽产生幼苗。通过机械摩擦至裸露种仁并激素浸泡处理后，筛选出NAA与GA3混合激素溶液浓度为100.0 mg/L时，W14发芽率最高（表1）。共得到发芽种子苗52株，及时转移到15.0 cm×25.0 cm装土的塑料花盆中，放于大棚，最终获得实生苗47株，随后进行正规盆栽管理（图1）。

表1 NAA与GA3激素组合处理后W14种子发芽数

2.2 SC205和KU50嫁接材料培养

栽培木薯品种SC205与KU50主要依靠茎秆繁殖，因此选取长度约10.0～12.0 cm且较均一的种茎，每个种茎保留3～4个芽眼，每个品种种植30盆，可保证成活率达100%，最终SC205成活30株，KU50成活30株（图1）。

图1 W14、KU50和SC205嫁接适龄植株形态

2.3 芽接与劈接方法比较与选择

本研究采用了芽接与劈接两种嫁接方法。芽接是选取生长健壮的芽片，嫁接于盆栽苗上。结果表明芽接后，因芽片失水率较高，容易干枯脱落，成活率最高只有20.0%，而采用劈接法，接穗选取适当长度，缓苗轻，在适宜的管理后，成活率在60.0%以上，最高成活率达87.0%（图2）。

2.4 劈接法获得的相互嫁接植株

采用劈接法，对野生种与栽培种分别进行相互嫁接，每个品种嫁接15株，并对嫁接后植株的生长过程进行观察（图3）。最终得到成活的嫁接品种W14/KU50（W14为接穗，KU50为砧木）13株，W14/SC205（W14为接穗，SC205为砧木）11株，KU50/W14（KU50为接穗，W14为砧木）9株，SC205/W14（SC205为接穗，W14为砧木）9株。保留W14、SC205和KU50非嫁接苗各15株作为性状评价对照材料。

图2 芽接与劈接的成活率

2.5 嫁接植株的移植与田间管理

嫁接苗适应外界环境后，同对照植株一起移栽于海南省海口市澄迈县木薯种植基地。每个品种选取9～12株，按正规田间试验随机区组设计，移栽大田，3次重复。由于10～11月份海南雨水较多，12月至翌年1月温度持续降低，移栽苗长势缓慢，因此需要定期观察其生长势，及时加深排水沟，除草，浇灌水肥，喷洒农药以及搭建保温棚等。

图3 野生与栽培木薯相互嫁接植株的生长过程

3 讨论

本研究选取的野生型材料为W14，引自于巴西地区，主要依靠种子进行繁殖。但中国境内土壤中缺乏分解其种壁的微生物，所以自然条件下种子不能够出苗。因此需要打磨种壁两侧，帮助种子破壳。利用激素浸泡，提高其活性。并在种子萌发期间，保证土壤水分适量及透气，防止其生虫或腐烂［22］。

嫁接的接穗与砧木，一般选用性状优良和适应力强的品种，同时必须兼顾两者的亲和性。一般较老或活性较差的接穗或砧木，木质部硬化，水分含量低，愈伤组织形成率低，将会导致嫁接植株成活率大大降低［23］。另有研究表明，自嫁接、同种间嫁接，会具有好的亲和性；同属之间的嫁接，其亲和性有显著差异；而同科不同属植株之间，嫁接则基本不亲和［8］，这种不亲和的内在机制尚不明确。从生理生化角度来说，嫁接不兼容植株，其形成层的愈伤组织分化速度较慢［24-25］，活性氧等应激反应化合物水平较高，而抗氧化基因的转录水平低［26-27］，并且嫁接部位会产生毒素与淀粉积累等，抑制了嫁接植株的成活与生长。

一般情况下，嫁接方法的选取和嫁接苗的成活率与植株的生理特性、茎秆表型特征以及外界温度、湿度等有关［28］。对于外部影响因素来说，嫁接嵌合部位连接与重建的基础，即是愈伤组织的形成，因此需要选择最适温度；光照在一定程度上抑制愈伤组织的分裂和分化，因此，嫁接前期需适当遮阴；嫁接嵌合部位的愈合阶段要求保证一定的湿度，为提升成活率，常采用培土、塑料带绑缚、套袋、涂蜡等措施进行保湿。对于嫁接手法的选择，要求与植株的茎秆形态与结构相符，主要分为劈接和芽接两大类。一般选择砧木茎秆粗度大于0.4 cm，将有利于提高嫁接成活率［29］。总之，嫁接时接穗选取适当长度，伤口光滑平整，无韧皮液残留，保证形成层对准，在品种兼容的前提下，并给予适宜的管理温度与湿度，可极大提高嫁接植株的成活率。

通过对比芽接与劈接两种嫁接方法发现，芽接的失败主要在于芽片水分的丧失。而劈接失败的主要原因则是由于伤流液在伤口处积累或外界水分透过封口薄膜进入伤口，植株从伤口处病变感染，致使嫁接失败。因此，本研究选取相对可控的劈接以减少接穗自身因素的限制。鉴于野生品种W14与栽培品种SC205、KU50分属不同亚种，两者嫁接的亲和性未知，所以嫁接手法与嫁接后管理条件的优化异常重要。因此本研究基于木薯茎秆的特征、成活率及手法难易等考虑，选择60～90 d新生苗，茎秆粗度0.5～1.0 cm，使用劈接作为主要嫁接手段。嫁接后，温度控制在27℃左右，暗培养24 h后，逐渐增加光照。嫁接前三天湿度控制在90%以上，后逐渐降低湿度至正常，从而使嫁接成活率提升至60.0%以上，甚至是87.0%。

木薯种质资源野生祖先种W14与栽培种SC205和KU50，在光合效率及淀粉积累方面存在极大差异。本研究通过野生木薯与栽培木薯的相互嫁接，对嫁接技术及嫁接后管理条件进行优化，从而获得嫁接嵌合植株，并把嫁接及对照植株进一步移栽大田，为以后挖掘木薯源、流、库之间内在协调机制做了前期工作，也为接下来的育种工作以及木薯生产提供参考。