Peters异常PITX2及PAX6基因型表型分析

孟 永，卢国华，谢 阳，孙新成，黄丽琴

0引言

Peters异常(Peters’ anomaly，PA)是较少见的眼前段发育不良性眼病，1906年由Peters首先报道，临床表现为先天性的角膜中央区混浊，对应区域的角膜后基质层变薄和后弹力层缺损、虹膜角膜粘连等[1]。该病在新生儿中的发病率国外报道为1.2/100000，绝大部分病例为散发，但也有一些常染色体显性及隐性遗传的报道[2-3]。Peters异常分型：按照文献描述的方法可将Peters异常分为Ⅰ型和Ⅱ型，仅有角膜混浊、虹膜前粘连而无晶状体异常者为I型，同时合并白内障或存在晶状体与角膜内皮粘连者为Ⅱ型，如果还伴有神经起源的全身异常则诊断为Peters综合征。临床中Peters异常患者可合并有其它眼部非特征性异常如巩膜化角膜、牵牛花综合征、Axenfeld-Rieger综合征(Axenfeld-Rieger syndrome，ARS)、永存原始玻璃体增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)等[4-5]。目前国外有Peters异常相关致病基因PITX2、PAX6等的分子遗传学的研究；而国内Peters异常PITX2和PAX6基因的报道很少[6-7]。PITX2是Paired-Bicoied同型盒蛋白家族成员,剪切翻译形成271aa，317aa，324aa三种亚型，这三种亚型同源结构域以及羧基端的序列相同，而氨基端不同，第60位的氨基酸同源结构域2(homeobox-2)可通过其内在的“螺旋-旋转-螺旋”(helix-turn-helix，HTH)结构与特异性DNA位点相结合，在发育中起着重大作用，第50位同源结构域氨基酸赖氨酸对于特异性结合DNA具有决定性作用；PAX6是眼球发育的主控基因之一，其编码产物是结合蛋白家族之一,其中的配对盒结构域和同源结构域作为高度保守的转录因子，可通过结合特定序列在视网膜、晶状体和角膜中广泛表达。在中国人群中进行该项研究，既可以了解中国人群Peters异常患者中PITX2和PAX6基因的突变情况，分析中国人群中Peters异常基因型表型的关系，为进一步研究其发病机制提供线索。

1对象和方法

1.1对象对2016-01-01/2019-03-30于常州市第二人民医院和第三人民医院就诊的15例Peters异常患者的临床资料进行分析，详细询问病史和家族史并进行PITX2和PAX6基因筛查；对发现的突变患者其家系成员均完善眼科检查，并排除全身的异常，收集临床的资料。80例正常对照者均无眼或全身遗传性疾病，和患者无任何血缘关系。遵循相关伦理原则,征得患者及所有成员的同意后抽血制备基因组DNA,并收集相关临床资料。

1.2方法

1.2.1聚合酶链反应(PCR)扩增采集Peters异常患者和所有成员外周血DNA，引物序列及扩增条件见本文作者之前发表Peters异常一文[6]。

图1正常对照者及突变患者测序图A：正常对照者；B：突变患者。

图2异源双链-单链构象多态性分析结果+：突变患者。

1.2.2突变基因筛查PCR产物纯化以后，加入BigDye双向测序反应，使用AB13730分析仪双向测序，测序发现的PITX2和PAX6新突变结果与NCBI数据库中PITX2及PAX6的序列进行比对，确定突变位点。根据人类基因组变异协会(HGVS，http://www.hgvs.org/)命名法对PITX2和PAX6突变进行命名。

1.2.3测序结果分析将碱基变异的测序结果输入DNAStar公司的MapDraw程序进行遗传信息改变的确定，NCBI上人类基因组数据库中,PITX2及PAX6两个基因的DNA序列作为标准序列，以识别碱基变异对氨基酸编码产生的影响。

1.2.4异源双链-单链构象多态性分析用异源双链-单链构象多态性(HA-SSCP)的方法对突变患者及其父母及80例正常对照进行对比验证。

2结果

对15例Peters异常患者PITX2和PAX6基因的外显子及邻近的内含子区域进行直接测序，15例Peters异常患者PAX6基因未能发现任何突变，患者中检测到1个已报道PITX2缺失突变c.296delG(P.R99fsx56)，正常对照者及突变患者测序图对照(图1)。分析其详细临床资料，这是中国首次报道伴有ARS的Peters异常眼病PITX2基因突变。

2.1基因突变筛查Peters异常1例及ARS合并症患者中发现一PITX2基因突变，该突变为缺失突变，位于PITX2A的第五外显子内，编码区第296位的碱基G缺失，该碱基缺失的后果会导致羧基端读码框架的移位，使编码的第98位氨基酸和原蛋白发生偏离，并且移位的读码框架在编码第153个氨基酸后产生了一个提前的终止密码子，致使理论上不能继续编码蛋白，致使PITX2羧基端丢失。

2.2异源双链-单链构象多态性分析结果异源双链-单链构象多态性的方法对直接测序结果做了进一步证实，结果示该患者条带不同于正常对照者(图2)，该患者家系中的表型正常的患者父母及80例正常对照者中均未发现同样突变，证明该患者的PITX2基因的突变存在。

图3突变患者双眼眼前节照相A：右眼；B：左眼。

图4图3同患者术后6mo双眼眼底照相A：右眼：未见明显异常；B：左眼：黄斑区发育不良。

2.3 PITX2突变患者病例资料PITX2突变患者，男，45岁，因“双眼视物不见40余年”来我院门诊求进一步诊治(双眼眼前节照相见图3)。既往史：患者诉自出生被发现左眼发白，否认吸氧史、家族遗传病史以及外伤史。眼科检查：双眼水平性眼球震颤，视力右眼为0.3，左眼为光感，眼压：右眼19mmHg，左眼18mmHg。A超扫描眼轴右眼为26.00mm，左眼为27.00mm，由于双眼的眼球震颤明显，双眼验光：测不出。患者右眼角膜透明，虹膜发育不全虹膜萎缩裂孔形成，周边虹膜与角膜粘连，典型的改变是粗大的线样条带自虹膜周边部跨越房角附于Schwalbe线上，晶状体略混浊，眼底未见明显异常；左眼角膜中央混浊，直径5mm×5mm，白色混浊区的角膜后部基质变薄和后弹力层缺损，虹膜角膜粘连，周边角膜血管化，余眼内结构不清。患者及家属要求行左眼手术治疗，向患者详细介绍了左眼的自然病程、手术风险及并发症后，最后行左眼穿透性角膜成形术，术中见虹膜角膜黏连，瞳孔大小约2mm，白内障形成，随术中予以联合白内障摘除+眼前段玻璃体切除术，术后视力无明显提高。术后6mo患者复查，左眼角膜植片透明，眼底可见黄斑区发育不良(图4)。临床诊断：右眼ARS，左眼Peters异常Ⅱ型。

3讨论

眼前段发育不良(anterior segment dysgenesis,ASD)是一系列眼前段组织结构形态异常疾病的总称，可分为不同的亚型：ARS、PA、无虹膜等，这些亚型被认为是由神经嵴细胞的异常迁移引起的，它是受局部因素、受体、感应器以及视杯和眼周间质等组织之间的信号相互作用的共同结果[8]。Peters异常和Axenfeld-Rieger综合征均可引起眼前段组织结构形态异常，患者常因眼压升高引起青光眼，最终导致视力严重障碍，是致盲性眼病。在本研究中，我们对2016-01-01/2019-03-30于常州市第二人民医院和第三人民医院就诊的15例Peters异常患者进行PITX2及PAX6基因突变分析，发现1例新的突变，并分析临床表型，该患者双眼分别表现为ARS和Peters异常两种罕见的眼前段异常表型，且左眼眼底合并严重黄斑部发育不良；并且回顾性分析比较国内已报道的Peters异常患者PITX2及PAX6基因突变以及相关表型。

3.1 Peters异常与ARS临床特点Peters异常是先天性角膜混浊白斑中最常见的一种眼病，国外报道的新生儿发病率为1.2/100000，主要为散发病例，亦有常染色体显性及隐性遗传的报道。Peters异常同时合并白内障或存在晶状体与角膜内皮粘连者为Ⅱ型。ARS是临床中少见病，患者可双眼发病，发病率约为1/200000，典型的特点为周边部角膜增厚突起和前移的Schwalbe线(角膜后胚胎环)，虹膜的发育异常为：虹膜变薄裂孔或多瞳形成，瞳孔异位变形，葡萄膜外翻；ARS患者可有全身的异常如面额部的发育异常、牙齿发育不良，脐周赘皮等。两种疾病眼压升高导致的青光眼发病率约为50%。本研究中的该突变患者临床特点：(1)双眼先天起病，水平眼球震颤，斜视；(2)患者右眼角膜透明，虹膜发育不全虹膜萎缩裂孔形成，周边虹膜与角膜粘连，可见角膜后胚胎环；(3)左眼角膜中央混浊，直径5mm×5mm，白色混浊后方的基质变薄和后弹力层缺损，中央虹膜角膜粘连，合并白内障；以上临床特点符合右眼ARS和左眼Peters异常Ⅱ型的临床诊断。

3.2 Peters异常基因型-表型的关系已报道的PITX2基因突变大多导致Axenfeld-Rieger综合征，1977年Awan[9]首次将一患者右眼ARS和左眼Peter异常合并为Peters-Rieger综合征，同时也提到了Peters-Rieger综合征的复杂性眼部和全身异常，但未进行相关基因分析；1999年W-Doward第一个报道PITX2突变可引起Peters异常，2000年Perveen等发现PITX2基因突变导致一患者左右眼Axenfeld-Rieger综合征和Peters异常两种眼病[10-11]，这似乎意味着两者眼病发病原因间某种共同联系。W-Doward等报道1例PITX2基因第3内含子位点A～T突变引起Peter异常，而对侧眼有白内障和虹膜发育不良，并有牙齿和脐带异常，另有轻度左房发育不全病例，在1999年的功能分析中表明，被诊断为Peters异常合并Axenfeld-Rieger综合征。神经嵴细胞紊乱也影响身体的其他部分，除典型的全身表现外，还报告了其他不寻常的眼部异常。Bhate等[12]和Park等[13]分别报告了2例ARS患者眼外肌发育不全引起的斜视。眼外肌起源于中胚层，神经嵴细胞起源的中胚层的发育障碍可能解释了眼外肌的临床表现。

2010年贾秀华等报道了1例10月龄的中国男婴PAX6的新突变P.Asn17Lys，该突变患者具有Peters异常临床特征，先证者双眼均有小角膜、小眼球、眼球震颤、先天性角膜白斑、虹膜发育不良和前极部白内障，B超检查眼部表现为玻璃体和视神经结构异常，对患者进行了PITX2和FOXC1基因突变筛查，但均未发现突变[7]。2011年Zhang等[14]报道了中国人群中PAX6基因同一突变导致家系中不同患者眼部表型不同的病例。2016年黄丽琴等[6]报道1例Peters综合征患者P.Arg69His突变，而国外文献报道的该突变导致Axenfeld-Rieger综合征,该突变可导致PPS和ARS两种不同的眼前段发育不良临床表型。PA以及ARS均是临床少见病。Peters异常与ARS通常被认为眼前段发育不良的两种眼病，而临床中Peters异常患者可合并有其它眼部异常：包括小角膜、白内障、永存原始玻璃体增生症等，目前国外Peters异常合并ARS的PITX2的研究也仅有2篇，在本研究中，我们对15例Peters异常患者进行了PITX2基因和PAX6基因突变的筛查，PAX6基因未能发现突变，PITX2检测到了1种新的框移突变c.296delG(P.R99fsx56)，该例患者右眼ARS合并左眼Peters异常。

PITX2基因突变可引起同一患者ARS合并Peters异常表型，国外亦有FOXC1突变引起患者ARS合并Peters异常表型。2002年，Honkanen等[15]首次报道了由FOXC1基因点突变(Phe112Ser)引起的ARS和PA双眼异常，患者无全身异常，视神经正常，眼压正常，无青光眼发生。Berry等[16]已经证明FOXC1和PITX2相互作用的，并推测这种相互作用在胚胎发生过程中神经嵴细胞的正确迁移分化必不可少，从而促进眼前段正常发育，从而解释了两基因突变能产生相同的表型原因。PITX2属于Paired-Bicoied同型盒蛋白家族,60个氨基酸组成的同源结构2可由其内部的“螺旋-旋转-螺旋”结构与特异性的DNA位点相结合，在个体发育中起重要作用。PITX2基因在视网膜以及晶状体中无正常表达，但该研究中的患者眼底合并有黄斑发育不良，PAX6编码产物属于结合蛋白家族,同源结构域识别、结合特定序列而调节其靶基因的表达，已有研究表明该基因与角膜、虹膜、晶状体形成后期、神经视网膜形成密切相关，PAX6是同步不同来源的细胞间复杂相互作用的关键因素，而这些细胞类型都是适当的前后眼形态发生所必需的。但在本研究中患者PAX6基因的筛选阴性，对于该患者发生严重眼底黄斑发育不良的原因，有一些可能的解释：(1)可能存在尚未发现的修饰基因突变或其他一些影响表型的基因；(2)下游靶基因或辅助因子基因的特定等位基因可能与患者广泛的眼病有关。

在本研究中，我们对中国人群中的15例Peters异常患者进行PITX2及PAX6基因突变的筛查，并分析比较国内已报道的Peters异常PITX2及PAX6基因突变。这是目前国内第一个报道Peters异常合并ARS眼病PITX2基因突变c.296delG(P.R99fsx56)，结果丰富了PITX2基因突变频谱，并研究其相关表型，有助于进一步了解该复杂疾病，阐明其可能发病的分子遗传学病因，希望这方面的进一步研究能为Peter异常和Axenfeld-Rieger综合征的确切机制提供依据；本研究更进一步提醒我们临床眼科医师，对于先天性角膜混浊病例，应该结合眼前段及眼后段共同分析的重要性，对Peters异常患者的手术效果提供有价值的信息。由于Peters异常与ARS是临床少见病，Peters异常合并ARS眼病临床中更是少见，本研究中由于样本量少，因此PITX2和PAX6基因与该Peters异常的关系还有待进一步研究。