NF-κB靶向放疗增敏作用及其机制研究进展

申丽君综述 陈始明审校

迄今为止，恶性肿瘤仍旧是居民致死的主要原因之一，其治疗手段有单纯的手术、放疗、化疗、手术联合放化疗、免疫治疗以及近期新兴的基因疗法等。虽然肿瘤治疗的手段已越来越多，放射疗法仍是一种有效的且高性价比的治疗方法。放射疗法杀死肿瘤细胞的生物学效应取决于辐射的种类、总剂量、分布率和目标器官[1]。放射线导致肿瘤细胞死亡的形式有细胞凋亡、坏死、自噬、有丝分裂突变、程序性坏死和衰老等[2]。早期鼻咽癌和非小细胞肺癌对放射治疗极为敏感，患者放疗后生存率很高；乳腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤等对放射疗法不敏感，患者放疗后生存率较低[3]。尽管放射疗法是一种十分有效的治疗方法，但大部分患者在经过几个疗程的放射治疗后，会出现放疗敏感性降低或放疗耐受的情况，从而导致放射疗法的治疗效果降低或肿瘤复发转移的情况。

近年来，研究肿瘤放疗抵抗的原因及其相关机制的报道不断增多。如PI3K/Akt[4]、Wnt/β-catenin[5]、ATM[6]、NF-κB[7]等信号异常与放疗抵抗的关系。在这些信号当中，NF-κB的激活被认为是保护细胞、阻碍细胞凋亡的关键因子。因此，靶向NF-κB的放疗增敏具有较大的研究前景。本文就NF-κB转录因子的组成、功能，其在放疗过程中激活的分子机制以及其靶向抑制剂在放疗增敏中的作用等分别进行综述。

1 NF-κB转录因子的发现、组成及其作用

David Baltimore于1986年发现了核因子κB (nuclear factor-kappa B，NF-κB)，其分布广泛，可由细菌和病毒抗原、T和B细胞、有丝分裂素、细胞因子、氧化低密度脂蛋白以及超氧自由基、一氧化氮等多种刺激剂诱导而成。它存在于细胞核中并结合B细胞中免疫球蛋白kappa链的启动子。在哺乳动物细胞中,NF-κB家族转录因子是由RelA (p65)、c-Rel、RelB、p50 (NF-κB1)和p52 (NF-κB2)等5个不同亚基组成的同质二聚体和异质二聚体。

NF-κB信号转导由经典路径和非经典路径2条主要的路径组成，其主要涉及NF-κB、IκB激酶(IKK)、IκB和NF-κB的家族成员[8]。经典信号通路和非经典信号通路都能引起NF-κB的激活。在经典信号通路中，配体与表面受体结合导致IKK复合物的招募和激活，随后IKK复合物磷酸化IκB，最后导致其蛋白酶体的降解及NF-κB转位至细胞核激活靶基因。在非经典通路中，配体与受体结合导致NF-κB诱导激酶的激活，与IKKα共同作用引起磷酸化依赖性泛素化和p100的加工，以及形成RelB/p52活性异二聚体[9]。

NF-κB参与调控许多形式的免疫和炎性应答。它是细胞凋亡及细胞周期的重要调控因素。在正常生理状态下，NF-κB是处于抑制状态的，并且通过与抑制蛋白IκBs结合隐藏于细胞质之中。NF-κB调控的基因与细胞增殖和抗凋亡途径相关，使得NF-κB被激活的肿瘤细胞更容易出现放疗敏感性降低、放疗抵抗的情况。多种分子或信号通路能够激活NF-κB，继而以这些重要分子或信号通路为靶点，靶向抑制NF-κB的活性，从而提高肿瘤的放疗敏感性。

2 NF-κB激活的分子机制

2.1 ATM及DNA-PK信号通路 放射线照射后，NF-κB信号通路在细胞的DNA损伤过程中扮演着重要角色，Veuger等[10]报道ATM对NF-κB的激活具有重要作用。He等[11]的研究也阐述了ATM在肿瘤细胞放疗环境下对NF-κB信号通路的影响：IKK直接使IkB磷酸化，从而激活NF-κB。根据目前的实验研究，ATM与IKK之间联系主要有两方面。首先是ATM激酶，DNA双链断裂后，Mre11-Rad50-Nbs1(MRN)复合体迅速募集到断裂的DNA双链周围，随后使ATM磷酸化。通过TRAF结合基序，ATM激活TRAF6，从而导致Ubc13介导的k63关联的聚氨酯合成。聚氨酯的形成触发了导致TAK1磷酸化的cIAP1、TAK1/TAB2和IKK复合物的生成[12]。激活的TAK1使IKK磷酸化，磷酸化的IKK能导致IκBα的磷酸化和泛素端依赖降解并释放NF-κB(主要是p50/p65二聚体)。这些释放物在细胞核中可自由活动。

其次是P53诱导的死亡结构域蛋白(PIDD)。PIDD经过两处结构化处理，最后生成了一个48kDaN末端片段和一个包含死亡域(DD, PIDD-C)的51kDa终端片段，后者经进一步裂解产生37kDa片段(PIDD-CC)[13]。研究发现：细胞一旦接受电离辐射，PIDD-C转移到细胞核中并形成一个RIP1 (受体相互作用蛋白1)和IKKγ的复合体。此复合体可促进IKKγ SUMO化。当ATM与IKKγ结合并使IKKγ磷酸化时，两个级联反应汇聚后IKKγ出现泛素化。磷酸化和泛素化的IKKγ仍旧与ATM结合，转移出核内，然后与ELKS(富含谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和丝氨酸的蛋白质)结合，活化IKK复合体，激活的IKK使IκBα磷酸化并使IκBα随后泛素化，靶向降解蛋白酶体[14]，激活NF-κB。

此外，细胞暴露于电离辐射会导致DNA双链的断裂，而DNA-PK的调节亚基与双链DNA的末端结合，从而导致DNA-PKcs的激活。表皮生长因子受体(EGFR)被电离辐射激活的Src磷酸化，然后穿梭到细胞核中[14]。EGFR向细胞核的易位伴随着细胞核中Ku70和Ku80蛋白的增加，最终导致DNA-PK的核激酶活性增加。最后使IκBβ磷酸化，激活NF-κB。因此，DNA-PK以不同的方式激活NF-κB，而且并不是由细胞质转移到细胞核内的NF-κB，而是核内磷酸化的NF-κB与IκBβ结合使NF-κB激活。

NF-κB激活后，其下游的细胞生存及抗凋亡方面的靶基因相应的高表达，肿瘤放疗敏感性相应下降。

2.2 VEGF/PLC-γ/PKC/NF-κB信号通路 血管内皮生长因子(VEGF)已经被证明是一种生存因子，它能对抗电离辐射诱导的细胞凋亡，从而起保护肿瘤细胞及正常细胞的作用。Yadav等[15]发现VEGF能够降低电离辐射后的细胞损伤并增强放疗抵抗作用。此外，脑肿瘤患者放疗后血清VEGF增高，并且在多种人源肿瘤细胞系中，单次10 Gy照射24 h后即可诱导VEGF的分泌增加[16]。因此，电离辐射后，VEGF通路被激活。VEGF与其受体VEGFR2(KDR)结合并活化磷脂酶C(PLC)-γ的催化活性；而抗KDR抗体可以阻碍PLC-γ酪氨酸磷酸化[17]。活化的PLC通过水解磷脂酰肌醇4、5-二磷酸[PtdIns(4,5)P2]生成肌醇1,4,5-三磷酸腺苷[Ins(1,4,5)P3]和1,2-二酰基甘油(DAG)，然后增加细胞质中磷酸二酰肌醇(DAG)和三磷酸三醇(IP3)的浓度。Ins(1,4,5)P3介导内质网(ER)中Ca2+释放，DAG招募并激活蛋白激酶C (PKC)。凝血酶可以激活PKCα和c-Src激酶活性，而后诱导PKCα与IKKα/β之间的相互作用。同时，凝血酶也可以诱发c-Src和IKKα/β联合，并最终激活PI-PLC/PKCα/c-Src/IKKα/β信号通路诱导激活NF-κB。此外，Karki等[18]的研究发现：c-Src和IKK复合体之间的直接相互作用导致IKKβ的磷酸化，且这种磷酸化依赖于PKC。反过来讲，c-Src和IKK复合体诱导IκBα的磷酸化和激活NF-κB。

2.3 Gadd45α/p38/bcl-2/NF-κB信号通路 生长阻滞和DNA诱导损伤45(Gadd45)蛋白作为压力传感器发挥着重要作用。对生理变化或环境变化的反应研究发现：Gadd45参与了细胞周期阻滞、DNA修复、细胞存活或细胞凋亡等过程[19]。在低至2Gy的X射线照射下，Gadd45 mRNA水平在人源细胞中迅速升高[20]。此外，γ射线不仅在培养的细胞中可以诱导Gadd45 mRNA上升，在体外γ射线照射下，肝脏和其他一些组织中也能诱导Gadd45 mRNA的产生。Wingert等[21]证实在紫外线照射之下，通过Gadd45α/p38/NF-κB介导的生存途径，激活Gadd45α活化NF-κB通路，进而促进了造血细胞的生存。

3 NF-κB靶向抑制剂在放疗增敏中的作用

3.1 NF-κB特异性抑制剂 Kozakai及其团队研究发现新型NF-κB抑制剂DHMEQ可增强前列腺癌细胞的放疗敏感性[22]。在Kozakai的研究中，他们对LNCaP 和 PC-3两种前列腺癌的细胞系进行放射线照射及NF-κB抑制剂的处理，实验结果显示，放疗联合NF-κB抑制剂显著抑制了前列腺癌细胞的增殖，促进其凋亡，且抑制剂浓度越高，促凋亡的效果越明显。动物实验结果显示皮下成瘤至64 d时，DHMEQ抑制剂联合放疗组的平均瘤体体积分别是空白对照组、单独抑制剂组、单独放疗组的85.1%、 77.1%、64.7%，且通过评估裸鼠脏器及皮肤，未发现抑制剂DHMEQ有明显的毒副作用及不良反应。该结果证实新型NF-κB抑制剂DHMEQ联合放疗具有显著的抗肿瘤作用，并且这种特异性抑制剂所引起的毒副作用及不良反应较少。

还有研究发现，非甾体类药物如布洛芬可通过直接抑制IκBα激酶来抑制NF-κB活性，从而提高放疗敏感性；对于人源的前列腺癌细胞系DU145，联合COX-2抑制剂NS398比单独放疗的抗肿瘤作用更明显。然而以上抑制剂并没有特异性的抑制NF-κB活性，故发生不良反应的机会可能更大。此外还有文献报道靶向NF-κB的基因治疗可抑制前列腺癌细胞中NF-κB的活性[23]，提高放疗敏感性，但此方法应用于临床仍有较长的路要走。天然成分中的姜黄素和染料木素具有抑制NF-κB活性的作用，其是否能增加肿瘤放射治疗的敏感性也值得深入探讨[24]。

3.2 NF-κB活化后靶基因抑制剂——PARP-1抑制剂(AG-014699) 多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)是一种核酶，它能调节DNA损伤时的细胞反应，可作为细胞应对放射线照射后单链和双链DNA损伤的感受器。PARP-1在转录因子的协同调节中的作用可能是通过染色质结构的局部修饰和/或通过直接结合基因调控序列调控转录因子活性，或与包括Oct-1、NF-κB、AP-1和HIF-1a等转录因子在内的蛋白质之间的物理交互作用而实现。Veuger等[25]证实，与单独辐射的细胞系相比，敲除PARP-1的细胞系的放疗敏感性提高4倍，并且通过使用PARP-1小分子抑制剂AG-14361得到验证。

Hunter及其团队使用PARP-1抑制剂AG-014699研究了PARP-1在NF-κB活化后的作用，发现抑制剂AG-014699提高放疗敏感性的作用机制是由于抑制了NF-κB活化后的下游靶基因的表达[26]。其细胞实验结果显示：PARP-1-/-MEFs细胞的放疗敏感性是PARP-1+/+MEFs细胞的2.7倍；抑制剂AG-014699处理的PARP-1+/+MEFs细胞是单独放疗组的1.3倍。转录因子NF-κB在先天性和适应性免疫应答中具有重要作用，所以长时间使用NF-κB抑制剂可能会引起免疫缺陷。然而，在Hunter等[26]的研究结果中提到通过体外体内实验的验证，抑制剂AG-014699并没有引起潜在的不良反应或免疫缺陷，显示出良好的应用前景。

3.3 胶霉毒素抑制NF-κB的表达 用胶霉毒素(一种抗菌、抗病毒的因子)治疗肝癌细胞时发现：它可以通过抑制由辐射诱导的Gadd45α、p38、NF-κB的表达，从而提高实验细胞的放疗敏感性。Hur等[27]研究发现，胶霉毒素和射线照射联合使用对肝癌细胞HepG2的致死效果大约是单独使用射线照射的2.5倍；HepG2细胞在4Gy的辐射剂量下，72 h后流式检测凋亡结果显示，胶霉毒素和射线照射联合组的凋亡细胞数量为21.4%，较单纯放疗组、胶霉毒素组分别高17.1%、5.3%。此外，研究还证实：在受辐射照射的肝癌细胞中，胶霉毒素主要是通过抑制Gadd45a-P38-NF-κB介导的细胞存活途径来促进细胞的凋亡、提高放疗敏感性的[27]。因此，胶霉毒素联合放射治疗可被认为是提高肝癌细胞放疗敏感性的有效治疗策略之一。

Tang等[24]研究发现电离辐射能诱导Gadd45β的表达。Wang等[28]的研究进一步证实，暴露于电离辐射后，人乳腺癌MCF-7细胞中Gadd45β的表达将明显增加，且这种增加是由于NF-κB的激活所引起的。由NF-κB诱导的Gadd45β可以下调促凋亡的JNK表达。Hwang等[29]研究发现，在紫外线的辐射之下，NF-κB/Gadd45β通路活化能抑制MKK7-JNK通路活性从而促进造血细胞的生存。NF-κB的亚基p65与胞外调节蛋白激酶(ERK)的相互作用形成一个辐射诱导的适应性反应网络。反过来讲，Gadd45β进一步增强了NF-κB和ERK的活性，形成一个环状联系，从而延长细胞的生存时间[28]。因此，理论上可以通过使用这3种分子中的任何一种抑制剂来破坏这个环状关系，从而开发出一种增强放射敏感性的方法。然而，目前关于这方面的抑制剂还未在实验中得到证实，值得今后深入研究。

4 展 望

NF-κB是一个保护肿瘤细胞免受放射线照射损害的关键因素。因此，NF-κB成为肿瘤放疗中极有吸引力的放疗增敏靶基因。随着研究的不断深入，科研工作者已经通过细胞及动物实验的研究，发现了一些特异性极强的抑制剂，这些抑制剂或者直接抑制NF-κB，或者通过抑制激活NF-κB信号的关键分子从而达到使肿瘤对放射线治疗更加敏感的目的。这为NF-κB靶向的分子抑制剂在临床的使用奠定了基础，更为临床上的肿瘤放疗患者提供了更好的选择。今后的重点和焦点将是研发更多高效的、特异的NF-κB靶向抑制剂并开展相应的临床前及临床应用研究，从而应用于恶性肿瘤的临床放射治疗。这对耐放射性治疗的恶性肿瘤及放射治疗后复发的恶性肿瘤治疗具有重要的意义。