DNMT1抑制剂DC_517对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

徐雅娣，赵 兵，卞尔保，纪兴虎，杨志豪，汤 锋，万经海

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，术后易复发，患者术后常需辅以放疗及化疗[1-2]。DNA甲基化是一种由甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)介导的化学修饰，与胶质瘤的发生、发展密切相关[3]。因此，抑制DNA甲基化转移酶的功能可能作为治疗胶质瘤的靶点。近年来，DNMT抑制剂在临床试验中得到充分验证，如阿扎胞苷联合替莫唑胺可抑制IDH突变型胶质瘤的增殖[4]。DC_517是一种新的DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase-1，DNMT1)抑制剂，研究[5]显示，DC_517可显著抑制肿瘤细胞的增殖,但其在胶质瘤中的作用尚未可知。该文以人脑胶质瘤细胞LN18细胞系作为研究对象，探讨DC_517对LN18细胞系的增殖、迁移侵袭能力的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器DC_517购自美国MedChemExpress (MCE)公司；胎牛血清购自美国Gbico公司；胰蛋白酶、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)购自上海碧云天科技公司；山羊抗兔、山羊抗鼠抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；高糖培养基(DMEM)购于美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自上海贝博生物有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；基质胶购自美国BD公司；β-actin、增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA) 和G1/S-特异性周期蛋白-D1 (G1/S-specific cyclin-D1，Cyclin D1)等抗体购自美国Abcam公司；基质金属蛋白酶-9 ( matrix metalloproteinase-9，MMP9)抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；TS100型倒置显微镜购自日本Nikon公司；超净工作台购自苏州净化设备公司；ST-360酶标仪器购自上海科华实验系统有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人脑胶质瘤LN18细胞购自上海中科院。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱内培养。在显微镜下观察到细胞汇合率达到80%以上，即进行细胞传代。当细胞处于对数生长期时用于实验。

1.2.2CCK-8法检测DC_517对脑LN18胶质瘤细胞增殖的影响 取处于对数生长期的细胞，用胰蛋白酶消化并制成细胞悬液。每孔按4×103个接种至96孔板中，每组设置6个复孔，置于细胞培养箱中培养，待细胞贴壁后加入相应浓度的DC_517，继续培养至相应时间后，弃去含药培养基，每孔加入新鲜配制的含10 μl CCK-8溶液的培养基，置于培养箱中继续培养4 h后，在酶标仪上选择 450 nm 波长测定各组细胞吸光度(OD)值。实验重复3次，取实验结果的平均值作为最终实验结果。按公式计算细胞存活率=[(实验组OD值-空白组OD值)]/[(对照组OD值-空白组OD值)]×100%，以分组为横坐标，细胞存活率为纵坐标，绘制柱状图。

1.2.3细胞迁移、侵袭实验 取经不同浓度DC_517处理不同时间后的细胞，胰蛋白酶消化后用培养基重悬。调整细胞密度至1×105～10×105个/ml，加入事先处理好的Transwell小室，迁移实验每孔加入1×104个细胞，侵袭实验每孔加入7×104个细胞，24孔板下室加入500 μl含10%胎牛血清的培养基，注意不要产生气泡。培养箱分别培养24 h、48 h后，对附着在小室底部膜下侧的细胞用4%多聚甲醛固定后结晶紫染色，显微镜下拍照并计数细胞。

1.2.4蛋白免疫印迹实验 将DC_517处理好的细胞提取蛋白，并根据BCA法测定蛋白浓度，以蛋白体积 ∶5×SDS上样缓冲液体积=1 ∶4的比例加入蛋白上样缓冲液后100 ℃煮沸10 min。制备凝胶，加入等量的蛋白样品，每组加2组复孔。开始电泳，先80 V 电泳30 min,待电泳至分离胶时，改为120 V继续电泳60 min。电泳完成后切胶，切下目的蛋白，根据所切胶的大小，将PVDF膜用剪刀剪出比胶面积略大的PVDF膜，甲醇激活后敷在胶上，注意不要产生气泡。将胶置于转膜夹子中夹紧，转膜槽中转膜，时间根据目的蛋白分子量大小调整。转膜完成后，用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗5 min×5次，膜置于相应一抗中4 ℃过夜。第2天TBST洗5 min×5次后，用辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育约1 h，继续TBST洗5 min×5次，最后显影仪下进行化学发光检测，得到相应蛋白条带。

2 结果

2.1 DC_517加药处理后对LN18细胞增殖的影响与对照组比较，用浓度为1 μmol/L的DC_517作用于LN18细胞48 h后，细胞相对存活率明显下降，差异有统计学意义(F=6.714，P<0.05)，而作用24 h后效果不明显(F=6.714，P>0.05)，见图1A。用不同浓度DC_517(浓度分别为0、1、5 μmol/L)处理LN18细胞48 h后，CCK-8法检测结果显示DC_517对细胞增殖的抑制率呈现浓度依赖性(F=45.078,P<0.01)，见图1B。

图1 不同浓度DC_517处理LN18细胞不同时间后对细胞增殖及DC_517对LN18细胞增殖的影响

A： 1 μmol/L DC_517处理LN18细胞后对细胞增殖的影响；1: 0 h-1 μmol/L组;2: 24 h-1 μmol/L组;3: 48 h-1 μmol/L组; 与0 h-1 μmol/L组比较：*P<0.05; B: DC_517处理LN18细胞48 h后对细胞增殖的影响； 4: 48 h-0 μmol/L组;5: 48 h-1 μmol/L组;6: 48 h-5 μmol/L组; 与48 h-0 μmol/L组比较：#P<0.05,##P<0.01

2.2 DC_517加药处理后对LN18细胞增殖相关蛋白表达的影响如图2A，用浓度为1 μmol/L的DC_517作用于LN18细胞，与对照组比较，PCNA和Cyclin D1相对表达量在作用48 h后降低，差异有统计学意义(F=13.520、F=96.005，P<0.01)；作用24 h后，Cyclin D1蛋白相对表达量降低，而PCNA蛋白相对表达量无明显变化(F=96.005，P<0.05；F=13.520，P>0.05)。如图2B，用不同浓度DC_517处理LN18细胞48 h后，各DC_517处理组PCNA和Cyclin D1 蛋白表达水平显著低于对照组(F=170.010、F=79.676，P<0.01)，且随DC_517浓度的升高，两种蛋白的表达水平相应降低。

2.3 DC_517加药处理后对LN18细胞迁移、侵袭力的影响如图3A所示，用浓度为1 μmol/L的DC_517分别作用于LN18细胞0 h、24 h、48 h，与对照组比较，DC_517作用24 h后细胞迁移数未见明显减少，而作用48 h后，细胞迁移数明显减少(F=27.952,P>0.05；F=27.952,P<0.01)。用不同浓度DC_517处理LN18细胞48 h后，与对照组比较，各DC_517处理组细胞迁移数减少，且细胞迁移数随着DC_517浓度升高而减少(F=93.278，P<0.01)，见图3B。除此之外，DC_517对LN18细胞侵袭力的影响呈现出与其对细胞迁移相似的结果(F=22.013，P>0.05；F=22.013，P<0.01；F=37.597，P<0.01)，见图4。

图2 DC_517对LN18细胞增殖相关蛋白的影响

A： 1 μmol/L DC_517处理LN18细胞后对增殖相关蛋白的影响；1: 0 h-1 μmol/L组;2: 24 h-1 μmol/L组;3: 48 h-1 μmol/L组; 与0 h-1 μmol/L组比较：*P<0.05，**P<0.01; B: DC_517处理LN18细胞48 h后对增殖相关蛋白的影响；4: 48 h-0 μmol/L组;5: 48 h-1 μmol/L组;6: 48 h-5 μmol/L组; 与48 h-0 μmol/L组比较：##P<0.01

图3 DC_517对LN18细胞迁移的影响 ×100

A： 1 μmol/L DC_517处理LN18细胞后对细胞迁移的影响；A1: 0 h-1 μmol/L组;A2: 24 h-1 μmol/L组;A3: 48 h-1 μmol/L组; A4：各组直方图；与0 h-1 μmol/L组比较：**P<0.01; B: DC_517处理LN18细胞48 h后对细胞迁移的影响；B1: 48 h-0 μmol/L组;B2: 48 h-1 μmol/L组;B3: 48 h-5 μmol/L组; B4：各组直方图；与48 h-0 μmol/L组比较：##P<0.01

2.4 DC_517加药处理后对LN18细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响用浓度为1 μmol/L的DC_517作用于LN18细胞，与对照组比较，迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白相对表达量在作用24 h后未见明显变化，而在作用48 h后相对表达量明显降低(F=15.202，P>0.05，F=15.202，P<0.01)，见图5A。用不同浓度DC_517处理LN18细胞48 h后，与对照组比较，浓度为1 μmol/L和5 μmol/L组MMP9蛋白表达水平降低，且随着DC_517浓度升高，MMP9蛋白表达水平逐渐降低(F=67.840，P<0.01)。

图4 DC_517对LN18细胞侵袭的影响 ×100

A： 1 μmol/L DC_517处理LN18细胞后对细胞侵袭的影响；A1: 0 h-1 μmol/L组;A2: 24 h-1 μmol/L组;A3: 48 h-1 μmol/L组；A4：各组直方图；与0 h-1 μmol/L组比较：**P<0.01; B: DC_517处理LN18细胞48 h后对细胞侵袭的影响；B1: 48 h-0 μmol/L组;B2: 48 h-1 μmol/L组;B3: 48 h-5 μmol/L组；B4：各组直方图；与48 h-0 μmol/L组比较：##P<0.01

图5 DC_517对LN18细胞迁移侵袭相关蛋白的影响

A： 1 μmol/L DC_517处理LN18细胞后对迁移侵袭相关蛋白的影响；1: 0 h-1 μmol/L组;2: 24 h-1 μmol/L组;3: 48 h-1 μmol/L组; 与0 h-1 μmol/L组比较：**P<0.01; B: DC_517处理LN18细胞48 h后对迁移侵袭相关蛋白的影响；4: 48 h-0 μmol/L组;5: 48 h-1 μmol/L组;6: 48 h-5 μmol/L组; 与48 h-0 μmol/L组比较：##P<0.01

3 讨论

恶性胶质瘤是最常见和最致命的原发性恶性脑肿瘤，亟需有效的治疗[6]。目前胶质瘤的治疗仍以手术切除为主，辅以放射治疗及化学治疗，主要的化疗药物为替莫唑胺，但部分患者的化疗效果并不理想，文献[4,7]报道替莫唑胺联合DNMTs抑制剂阿扎胞苷可抑制IDH突变型胶质瘤的增殖，表明DNMTs抑制剂可能作为一种新的化疗辅助药物。

DNA甲基化是指在DNMTs的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(5mC)的一种反应，研究表明异常的DNA甲基化可以调控胶质瘤的发生、发展[3]。 DNMTs在DNA甲基化中发挥关键的催化作用，其主要包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，其中DNMT1是最早被研究且研究范围最广的DNA甲基转移酶[8]。大量的研究[5,9-11]表明，DNMTs抑制剂可通过抑制DNMTs的功能进而抑制异常的DNA甲基化发生，最终抑制肿瘤的进展。本课题组的前期研究[9]发现，DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA可以特异性抑制DNMT1活性，抑制异常的甲基化发生，激活沉默的抑癌基因DOK7，逆转胶质瘤细胞的生物学特征。据报道DNMTs抑制剂zebularine可抑制肝癌细胞的增殖[10]。此外，Borges et al[11]报道DNMT抑制剂可以降低乳腺癌细胞的侵袭力。DC_517是一种新的DNMT1抑制剂，并可显著抑制肿瘤细胞的增殖[5]。本实验研究表明用不同浓度的DC_517处理LN18细胞48 h后，DC_517抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移侵袭能力的作用随其浓度的增加而增强。此外用DC_517处理LN18细胞48 h后，DC_517可通过抑制增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1表达进而显著抑制胶质瘤细胞的增殖，通过抑制迁移侵袭相关蛋白MMP9表达进而抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭。以上结果表明DNMT1抑制剂DC_517可通过抑制增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1和侵袭相关蛋白MMP9的表达分别抑制LN18胶质瘤细胞的增殖和侵袭。

目前国内外已经报道的DNMTs抑制剂主要分为核苷类似物和非核苷类似物，核苷类代表药物主要有地西他滨和阿扎胞苷；非核苷类主要包括普鲁卡因、普鲁卡因胺、肼屈嗪和米托蒽[12-13]。核苷类似物具有化合物不稳定、细胞毒性大、副作用大等缺点，而非核苷类似物由于不破坏细胞RNA结构，结构稳定，特异性强，具有更广阔的临床应用前景,而本实验所用的DNMT1抑制剂DC_517即属于非核苷类似物类[5,14]。近年来，DNMTs抑制剂在临床试验中也得到充分验证，如阿扎胞苷可用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓细胞白血病，说明抑制DNMTs的功能可能成为治疗肿瘤的靶点[15]。本实验的研究结果表明，非核苷类似物类DNMT1特异性抑制剂DC_517可显著抑制胶质瘤LN18细胞的增殖和侵袭，为临床胶质瘤的化疗提供一定的借鉴。