下调MRP1表达可促进黏液表皮样癌细胞增殖能力增强

王春芳 王天珏

黏液表皮样癌（MEC）是头颈部最常见的原发性涎腺肿瘤［1］，占涎腺恶性肿瘤的35%，高分化黏液表皮样癌一般为无痛性缓慢生长肿块，恶性程度不高，但低分化MEC的生长速度快，恶性程度高且常累及周围神经，属高度恶性肿瘤，其5年生存率仅有30%［2］。

多药耐药相关蛋白（MPR1）一直被认为是一个能量依赖的膜蛋白转运子，通过转运化疗药物到细胞外引起肿瘤耐药，与肿瘤化疗的不良预后高度相关［3］。但也有研究发现MRP1通常在成人肝脏中的表达量不可查，但肝损伤后，再生区域的肝细胞中MRP1表达量却显著升高［4］，加之MRP1本身也是细胞内许多物质的转运子，怀疑MRP1表达量的改变是否通过调节细胞内底物的浓度来影响了细胞的生物学特征。

本次研究发现高分化MEC中MRP1高表达，但低分化MEC中的MRP1表达量显著减少。为研究MRP1在MEC中发挥了什么作用的，利用RNA干扰技术下调MRP1表达，并通过体内和体外实验验证了MEC细胞肿瘤生物学特性的改变，为将来MEC的个体化治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 黏液表皮样癌患者肿瘤样本

收集北部战区总医院和平分院病理科15例高分化MEC和15例低分化MEC患者的组织切片样本，这些患者均接受了MEC切除术。

1.2 免疫组织化学染色

本研究使用免疫组织荧光的方法来检测MRP1在MEC肿瘤组织中的表达和定位。样本固定、包埋，切片（5μm），脱蜡。依据使用说明，使用链霉素生物素过氧化物酶检测试剂盒（北京中山生物技术公司）进行显色。MRP1鼠抗人单克隆一抗（1∶200；Santa Cruz，Biotechnology公司，USA）孵育过夜。荧光二抗（15μg／ml Affini-Pure羊抗小鼠，北京中山生物技术公司），37℃孵育30 min。DAPI（1μg／ml）衬染细胞核，激光共聚焦显微镜（FluoViewTMFV1000；Olympus公司，日本），40倍／1.2光圈观测。MRP1表达指数根据文献报道的方法分为1～9分［5］。

1.3 细胞培养

高转移黏液表皮样癌细胞系MC3由第四军医大学口腔医院细胞生物教研室赠与。MC3细胞培养在含10%RPMI1640胎牛血清（Gibco BRL）培养基中，内含青霉素和链霉素（100 U／ml，Sigma-Aldrich，USA）。

1.4 慢病毒转染

MRP1 shRNA knockdown利用慢病毒的PLKO ShRNA系统，利用Puromycin进行筛选。MC3细胞种植到6孔细胞培养板，调整细胞密度为40%，上清吸除后，加入病毒液（MOI＝20），4 d后检测GFP荧光表达情况，把稳定感染慢病毒MRP1-shRNA的细胞记为MC3-S，把稳定感染shRNA阴性对照慢病毒的MC3细胞标记为MC3-NC。

1.5 反转录聚合酶链反应

使用总RNA提取试剂盒（OMIKA，California，美国）提取细胞总RNA，使用Takara试剂盒（Reverse Transcriptase，Takara，日本）将RNA反转录为总cDNA（10μl），待用，反转录试剂混合液10 mmol／L，加总RNA模板5μl混合后离心，42℃，15 min；95℃，5 min；4℃，10 min。合成单链cDNA作为实时定量PCR的模板，引物序列见表1，GAPDH为内参。实时定量qPCR使用Premix Ex TagTMⅡ试剂盒（Takara），95℃30 s；95℃5 s，56℃34 s，72℃15 s，45个循环。相对表达水平用ΔΔCT显示。

表1 PCR引物序列及反应条件Tab 1 Primer sequences and PCR conditions

1.6 Western blot

冰浴收集细胞裂解液（50 mmol／L Tris-HCl，150 mmol／L NaCl，50 mmol／L EDTA，1%NonIdet P-40，0.5 mmol／L phenylmethylsulfonyl fluoride，2μg／ml pepstatin A），蛋白定量，蛋白样本（20μg／ml）用12%分离胶分离，并电转位（100 V，90 min）至硝酸纤维素膜（Sigma-Aldrich），5%脱脂奶粉封闭，小鼠单克隆抗体（1∶500，Santa Cruz）4℃过夜，IRDyeTM800兔抗小鼠二抗（1∶20 000；Rockland Inc，USA）孵育1.5 h，Odyssey imaging系统（LI-COR Inc.，Lincoln）显影，β-actin（1∶1 000，Boster公司，USA）用来作为对比内参。

1.7 MTT分析

分别将处于对数生长期的不同组别MC3细胞株接种于96孔板，每孔约3 000个细胞，常规培养24 h后，每天于相应孔中加新鲜配制的MTT溶液（5 g／L）20μl，37℃培养4 h，吸弃孔内上清，每孔加150μL DMSO振荡（10 min）以溶解结晶；490 nm波长在ELISA仪上测定各孔光吸收值（490 nm）；以每5个重复孔A值的平均数为纵坐标，以时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。

1.8 平板克隆形成实验

分别将500个细胞接种于100 mm培养皿，每3 d更换一次培养液，培养2～3周，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，20%甲醇固定15 min，Giemsa液染色40 min，用克隆计数仪自动计数，比较不同背景下的细胞克隆形成能力的差异。

1.9 免疫缺陷小鼠的MC3移植瘤模型

选取4～6周龄、体重18～20 g的雄性裸鼠为实验对象。无菌条件下收获培养的MEC细胞，PBS调整细胞浓度至5×106／ml，0.1 ml细胞液注射于小鼠背部皮下。待10 d后细胞实体瘤形成，每3 d用游标卡尺测量肿瘤的大小，肿瘤的体积公式：V＝d2×D／2（d：肿瘤的短径，D：肿瘤的长径），连续记录21 d。

1.10 统计学分析

2 结 果

2.1 MRP1在高分化MEC中的表达量显著高于低分化MEC中的表达量

通过免疫组织荧光对高分化及低分化MEC组织石蜡切片进行染色，并进行评分。结果发现MRP1在所有的黏液表皮样癌样本（30／30）中有表达。然而在高分化MEC中，MRP1主要位于细胞膜上，而在低分化MEC中，MRP1主要位于细胞质内，绿色荧光为为MRP1蛋白，蓝色为DAPI的细胞核衬染，显示了MRP1在高分化MEC中和低分化MEC的亚细胞定位：免疫荧光染色可见MRP1主要位于高分化黏液表皮样癌的细胞膜上且表达量很高，但在低分化黏液表皮样癌中却主要位于细胞质中，切表达量明显较低；（图1）。而且，统计分析MRP1在组织切片中的表达指数（EI），MRP1在高分化MEC中的表达量（EI＝5.7±1.2）显著高于MRP1在低分化MEC中的表达量（EI＝1.4±0.3，P＜0.01）（图2A）。

图1 MRP1在MEC中的表达 （IHC，×40）Fig 1 MRP1 expression in MEC （IHC，×40）

图2 MRP1表达量的下调显著增强了黏液表皮样癌细胞的生长速度Fig 2 Growth promotion of MEC cells by down-regulation of MRP1 expression

2.2 MRP1 shRNA显著下调MC3中的MRP1表达

实时定量PCR发现：与MC3-NS细胞对比，MC3-S细胞内MRP1的mRNA表达量显著下调（N＝3，P＜0.01），值得注意的是，MC3／5FU-S细胞内，MDR1的mRNA表达量也下降了66%±8.5%（P＜0.01）（图2B）。Western blot验证了该结果，与MC3-NS细胞相比，MC3-S细胞中的MRP1蛋白表达量也明显下降（图2C）。

2.3 下调MRP1后MEC细胞生长速度显著下降

MTT法检测MC3-NS细胞和MC3-S细胞的生长速度。从第3天开始，MC3-S细胞的生长速度就开始显著低于MC3-NS（图2D）。单克隆形成也显示MC3-S细胞（31±7）的克隆形成能力就显著低于MC3-NS细胞（116±14，P＜0.01），单克隆形成实验显示MRP1的下调显著增强了MC3的单克隆形成能力（图2E）；下调MRP1显著增加了MC3细胞的体内生长速度（图2F）。而裸鼠成瘤的体内实验也显示MRP1的下调显著降低的MEC细胞的恶性程度，与MC3-NC组相比（1 186±150）mm3，显MC3-S组的肿瘤生长速度著降低，肿瘤体积显著减小（370±41）mm3（P＜0.01）。

3 讨 论

MRP1一直被认为是肿瘤产生多药耐药的重要蛋白，前期研究也发现MRP1在MEC中高表达，是导致MEC多药耐药的重要因素之一，下调MRP1可以显著降低多种肿瘤细胞的耐药性，且MRP1的表达与多种肿瘤的化疗预后高度相关［6］。但是前期研究发现恶性程度更高的低分化MEC中，MRP1的表达量却较高分化MEC更少。因此，MRP1可能在黏液表皮样癌中还发挥着其它作用。

为了验证相关假设，通过shRNA下调MEC细胞（MC3细胞系）中MRP1的表达，并通过qPCR和Western blot验证了MRP1的下调水平，发现的是shRNA显著下调了MC3内的MRP1在转录和翻译水平的表达（P＜0.01）。在下调MRP1表达水平后，通过MTT检测了MC3细胞的生长曲线，发现MRP1的下调显著增强了MC3细胞的生长速度；而MC3细胞的单克隆形成实验也显示MRP1的下调显著增强了MC3细胞的单克隆形成能力。体外实验证实MRP1的下调可通过增强肿瘤细胞增殖能力和克隆形成能力增加肿瘤细胞的恶性程度。为了进一步验证此结论，将下调MRP1后的MC3细胞（MC3-S）注射于裸鼠皮下，并检测其生长速率，进一步验证MRP1的下调可显著增加了MC3细胞在体内的增殖速率。

实验结果首次发现MRP1的下调会显著增强肿瘤细胞在体内和体外的增殖能力和克隆形成能力，虽然大量研究表明，MRP1的下调可显著降低肿瘤细胞的多药耐药性，但本研究解释了为什么无法通过下调耐药基因来治愈肿瘤的原因。并未揭示MRP1增加黏液表皮样癌恶性程度的机制，但有研究发现MRP1是通过调节细胞内谷胱甘肽（GSH）的含量来调节细胞生物学功能的，MRP1是GSH的重要转运子［7］，而GSH是细胞内的主要抗氧化物质，可减缓细胞衰老并增强细胞生存能力［8］，MRP1的减少可能增加了细胞内GSH的含量，从而减少外源性物质所带来的伤害，这也许正是无法通过下调耐药基因来治愈肿瘤的原因。

总而言之，前期研究发现了黏液表皮样癌细胞中高表达MRP1，但并未解释MRP1除了作为药物转运蛋白之外的细胞机制。本研究进一步完善了MRP1在MEC中相关分子机制，并且我们认为MRP1可作为MEC的新的预后标志物进一步发挥作用，但详细机制仍需进一步研究。