核酸检测技术在青岛地区血液筛查中的应用研究

图 强 王爱英

为预防和控制输血相关传染病的发生，目前我国对献血人群实施的特异性传染性标志物的血液筛查项目主要包括乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝抗体(抗-HCV)、艾滋病抗体(抗-HIV)和梅毒抗体(抗-TP)。输血后病毒感染发生主要是由于献血者处于病毒感染“窗口期”献血，对于乙肝病毒感染来说，还存在献血者处于隐匿性感染(OBI)状态下献血[1～3]。因此探索新的血液筛查方法，采用更加敏感特异的方法缩短检测窗口期，尽可能减少OBI的漏检，对于增强输血及血液制品安全性具有重要的实际意义。而近年来发展的高度敏感、特异的核酸扩增技术(nucleic acidamplification techniques，NAT)可以将HBV、HCV和HIV的检测窗口期明显缩短，并且能够发现OBI感染者，提高血液制品的安全性[4]。本研究通过对血清学阴性待检标本进行NAT检测，以分析探讨血液筛查中开展NAT检测的必要性。

1.材料与方法

1.1 样本来源 2016年ELISA检测无反应性、ALT合格、无溶血、无脂血的50 582份全血标本进行了核酸检测。NAT检测的标本用真空EDTA抗凝留取血样5ml，于4h内分离血浆。

1.2 血清学检测 血液采集后次日由不同的检验人员采用2种试剂完成2遍ELISA项目(HBsAg，抗-HCV，抗-HIV，抗-TP)检测。①HBsAg试剂：初检采用上海科华试剂(批号201512431、201606021、201609341等)；复检采用北京万泰试剂(批号B20151228、B20160408、B20160926等)。②抗-HCV试剂：初检采用珠海丽珠试剂(批号2015121608、2016040408、2016051108等)；复检采用北京万泰试剂(批号CS20151208、CS20160605、CS20160807等)。③HIV试剂：初检采用珠海丽珠抗HIV-1/2试剂(批号2015122308，206051008、2016071708等)；复检采用厦门新创HIV Ag/Ab试剂(批号2015116707，2016066707，2016096712等)。④抗-TP试剂：初检采用上海科华试剂(批号201512261，201602071，201608241等)；复检采用厦门新创试剂(批号2015117527，2016057507，2016077515等)。HAMILTON STAR全自动加样仪(瑞士HAMILTON公司)，HAMILTON MICROLAB FAME(瑞士HAMILTON公司)。所有操作均按仪器和试剂盒说明书进行操作，最后由计算机软件判读结果。

1.3 NAT检测 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(1型)核酸检测试剂盒(PCR-荧光法，上海科华生物工程股份有限公司；批号20151218，20160207，20160411，20160617等);HAMILTON STAR全自动化核酸提取工作站(瑞士HAMILTON公司)，7500 Real Time PCR system荧光扩增分析系统(美国ABI公司)。采用HAMILTON STAR全自动化核酸提取工作站对样本进行检测:每个一级混样池(pool)包含8个纳入NAT检测的无偿献血者样本，全自动混样仪加样;一级混样池标本在全自动核酸提取仪中应用磁珠分离技术原理提取核酸，核酸扩增检测仪扩增检测HBV、HCV、HIV-1靶序列。为防止假阴性结果，每个标本及外质控品都加有内质控品(内标)，对核酸的提取、扩增进行全程监控，只有内标阳性的样品阴性检测结果才能判定有效，否则须重复该样品的检测。阳性pool继续做拆分实验，拆分实验阳性的标本判定为NAT阳性，阴性则判定为NAT阴性。

1.4 核酸反应性样本的病毒载量和乙肝五项检测 采用Grifoles公司的Procleix ULTRIO Assay和Procleix TIGRIS System对所有NAT阳性样本进行复测。HBV DNA阳性样本采用Roche公司COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV test进行病毒载量测定，采用上海科华生物工程股份有限公司ELISA法检测乙型肝炎血清标志物五项(HBsAg、抗-HBs、HBeAg抗-HBe和抗-HBc；批号201609341，201608181，201607161，201607171，201609181)，均按仪器和试剂盒说明书进行操作。

1.5 HBV DNA检出献血者追踪随访 通过在无偿献血时献血者留取的电话，对15名献血者进行追踪随访，但由于各方面的原因，只追踪随访到9名献血者，并对他们进行NAT和乙肝五项复测，另外6名献血者失访。

2.结果

2.1 NAT检测结果 50 582份酶免阴性样本共发现15份核酸三项(HBV DNA，HCV RNA，HIV RNA)呈反应性，均为HBVDNA，常规酶免两遍检测合格后HBV DNA阳性率为0.03%。

2.2 NAT检出样本复核检测结果 15例NAT检出标本采用诺华公司的Procleix ULTRIO Assay和Procleix TIGRIS System进行复核检测验证。其中15例全部为HBV DNA检出，未发现HCV和HIV-1 RNA检出者。

2.3 NAT检出标本定量检测和乙肝五项检测结果 15例HBV DNA检出样本中,1例乙肝五项检测全部阴性，1例仅抗-HBs阳性，单纯抗-HBc阳性6例，抗-HBc和抗-HBs共同阳性3例，抗-HBe和抗-HBc共同阳性3例，抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc共同阳性1例，结果见表1。

表1 核酸定量检测及乙肝五项检测结果分类

2.4 HBV DNA检出献血者追踪随访检测结果 对15例HBV DNA检出献血者中的1～9号献血者进行了1～2次追踪随访，血清学模式无变化，NAT复测及乙肝五项结果，见表2。

3.讨论

核酸检测能显著缩短血液感染病毒检测的“窗口期”，有效降低经输血传播疾病的风险。在《血站技术操作规程(2015版)》明确规定血液核酸检测技术可作为献血者血液检测方法之一[5]。

为进一步提高临床输血的安全性，评估在青岛地区开展核酸检测的必要性，我们对50 582例ELISA筛查阴性无偿献血者样本进行NAT检测，得到0.03%的阳性检出率，与成都地区(0.035%，15/43375)[6]的阳性检出率接近，而低于宝鸡地区(0.114%，30/68781)[7]，分析原因可能是因为人群分布的区域差异及采用不同的检测系统所致试剂灵敏度不同，可能还与混合检测样本的数量有关[8]。

除了感染早期的检测窗口期以外，多数HBsAg检测阴性但HBV DNA阳性的标本由OBI引起[9]，这是导致HBsAg筛查后输血传播感染HBV残余风险的主要原因。这些OBI的样本在乙肝5项血清学检测中，往往表现为抗-HBc阳性[9]。我们研究发现的15例HBsAg阴性、HBV DNA阳性标本中，只追踪到了9例献血者，为抗-HBc阳性伴有或不伴有抗-HBs或抗-HBe，可能为OBI。另外6名献血者未随访到，或者预留的电话无人接，或者是外地出差，还有就干脆不来。对献血者的随访工作，是献血服务的延伸，对这部分未随访到的献血者，我们期待在今后的工作中改变随访方式而有所改善。有1例乙肝五项检测全部阴性，可能为窗口期感染。另有1例单纯抗-HBs阳性者，也可能为OBI。这些OBI病例单纯采用血清学检测，可能会造成漏检，给血液安全带来较大的隐患。

表2 9例HBV DNA检出献血者追踪随访结果

从青岛地区无偿献血者的血液样本NAT检测的结果来看，目前的ELISA检测方法仍具有一定的血液残余风险，输血传播HBV残余风险明显高于HCV和HIV，将NAT技术与ELISA检测结合起来将有利于更好地提高输血安全系数，有效提高血液安全性。