昆仑雪菊表型性状及分子标记的遗传多样性研究△

樊丛照，郎乾坤，朱军，王果平，宋海龙，李晓瑾*

1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所/国家中医药管理局 新疆中药民族药资源重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830002；2.阿克苏市人民医院，新疆 阿克苏 843000

21世纪初，在和田援疆的干部发现，当地盛行饮用一种产自当地高海拔称之为“古丽恰尔”的花茶，气味浓郁，神清气爽。援疆干部们在给亲朋好友介绍时，根据产地和外观取名为“昆仑雪菊”。相传其分布于克里昂乡3000 m左右的高山草甸，极为稀少，市场多为采撷该野生种子栽培的产品。然而经植物分类学专家鉴定，“昆仑雪菊”系菊科双色金鸡菊CoreopsistinctoriaNutt.，原产于北美，为我国引种观赏花卉品种。但研究表明无论是植物形态还是化学组成，源于和田地区的本品与其他地区的皆有所不同[1]。

表型性状的统计分析是种质资源研究最基本的方法[2]，具有数据收集快、经济等优点[3]；分子标记能够直接精确地反映出遗传物质的差异，并表现出更高的多态性[4]，其中简单重复序列区间(inter-Simple Sequence Repeat，ISSR)具有操作简单、快速高效、遗传多态性高、重复性好等特点[5]，在药材产地评价和遗传多样性研究等方面已有广泛应用[6-8]。因此，本研究拟使用表型性状统计及ISSR分子标记等方法，研究不同区域雪菊种质资源表型性状与遗传物质的多样性，揭示不同产地间的差异，为正确定位“昆仑雪菊”提供科学依据，对发掘当地特色产品、服务于精准扶贫，具有十分重要的现实意义和科学价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 收集不同产区的19份雪菊种质资源，2016年5月种植于新疆昌吉职业技术学校试验田，试验条件一致。2016年8月分别采集120株的新鲜叶片，保存于-80 ℃冰箱备用，样品信息见表1。

表1 昆仑雪菊种质来源与样品信息

1.1.2 试剂 异丙醇(分析纯)；乙醇(分析纯)；Tris平衡酚(北京索莱宝科技有限公司)；RNase A酶(天根生化科技北京有限公司，批号：RT405-02)；2×TaqPCR MasterMIX(博迈德生物)；ISSR引物(参照British Columbia大学公布的引物序列，由上海生工合成)。

1.1.3 仪器设备 Anker TGL-16C型离心机(上海安亭科学仪器有限公司)；070-851PCR型扩增仪(An Analytik Jena company)；恒温金属水浴锅(天根生化科技北京有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表型性状统计 测定每株供试品的株高(ZG)、径粗(JC)、冠幅(GF)、分枝数(FZS)、第一分支的高度(FZG))、叶长/叶宽(YCK)、花冠直径(HG)、花蕊直径(HR)、花色(HS花瓣上的红色区域)、花瓣数(HBS)10个表型性状。

1.2.2 DNA提取及检测 采用改良CTAB区室法[9]，提取样品DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小及质量。

1.2.3 PCR扩增及检测 ISSR-PCR反应体系25 μL，包括2×TaqPCR MasterMIX 12.5 μL，H2O 9 μL，引物2.5 μL，DNA模板1 μL。反应条依次为预变性3 min；变性30 s，退火30 s，延伸30 s，循环35次；延伸5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

1.3 数据处理

1.3.2 ISSR-PCR扩增结果处理 对ISSR引物扩增条带进行赋值：清晰条带记作“1”，没有条带记作“0”；用POPGENE处理0/1矩阵图，计算多态位点百分率(PPB)、有效等位基因数(Ne)、Nei′s遗传多样性指数(H)、Shannon′s信息指数(I)、群体总基因多样性(Ht)、群体内的基因多样性(Hs)、群体间的遗传分化系数(GST)、基因流(Nm)；按非加权配对法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 表型性状的极差分级及多样性分析结果

120份样品的表型性状结果如表2所示，遗传多样性信息指数(H)大小依次为：株高>花冠=花色>茎粗>叶长/叶宽>冠幅>分枝数>第一分支的高度>花瓣数>花蕊直径。表型性状中株高的变异度和丰富度最大，为2.16；最小的是花蕊直径，为1.07。

表2 昆仑雪菊在表型性状各级别的分布量及其遗传多样性信息指数

2.2 表型性状的聚类分析

雪菊19个采集地的10个平均表型性状聚类后被分为2类(如图1)。第一类包括温泉县、兰州市、吐鲁番市、布尔津县、于田县、达坂城、阿拉尔、和田县，其中温泉县和兰州市的平均表型性状最近，其次是布尔津县和于田县。第二类包括民丰县1～2号、皮山县的1～5号、未知1～2号、特克斯、乌鲁木齐市；其中民丰县1号和2号的平均表型性状最近；其次是未知2号，乌鲁木齐市、皮山县1号和5号，未知1号和特克斯县。

图1 双色金鸡菊19个采集地表型性状聚类图

2.3 ISSR遗传多样性统计结果

14条引物共扩增出263个位点，分子量在100～5000 bp，不同引物扩增的多态位点数从13到24个不等，平均每个引物检测到18.78个位点，如图2，其中多态位点255个，占96.96%。总的Ht为0.292 2，种群内的Hs为0.149 8，种群间的Dst为0.142 4。物种水平上，PPB为96.96%、Ne为1.464 4，H为0.281 1，I为0.432 1；居群水平上，各种群的PPB差异较大，平均值为42.13%，平均有效等位基因数为1.259 0，平均H和I分别为0.149 8、0.223 1。见表3～4。

表3 ISSR反应体系中所使用引物的信息及扩增结果

表4 昆仑雪菊的遗传多样性参数

图2 引物841对昆仑雪菊供试样品1～30的扩增图谱

2.4 群体的遗传分化

POPGENE计算得到种群间的基因GST为0.487 4，即48.74%的遗传变异来源于种群间，51.26%的遗传变异来源于种群内；双色金鸡菊种群间Nm为0.525 9<1，表明基因交流处于低等水平；19个采集地之间的Nei′s遗传一致度在0.660 9～0.948 8，平均值0.824 0；遗传距离分布在0.052 6～0.414 1，平均值0.196 2。其中皮山县5号和达坂城两采集地之间的遗传一致度最高(0.948 8)，遗传距离最小(0.052 6)。

2.5 不同产地的聚类分析

19个雪菊采集地UPGMA聚类结果(如图3)在第15步被聚为5类：未知1号和特克斯县被聚为第一类；皮山县1～3号被聚为第二类；布尔津县、阿拉尔市、皮山县4～5号、民丰县、温泉县、和田县、达坂城、兰州市、于田被聚为第三类；未知2号、乌鲁木齐市、民丰县被聚为第四类，吐鲁番市被单独聚为第五类。

3 讨论

为了消除环境因素的干扰，本研究将来源于不同产地的双色金鸡菊种质资源在同一产地种植，并保证生长条件一致性。数量性状统计结果表明，不同种质资源的双色金鸡菊外观形态呈现显著差异，除了株高、径粗、冠幅等数量性状存在显著差异外，花色(花瓣上的红色区域面积)也存在显著的差异。总体来看，来源于平原地区的种质资源和来源于高海拔地区的种质资源分为两大类群，这表明，环境因素可能在一定程度上影响了双色金鸡菊遗传物质的分化。

遗传多样性研究结果表明，双色金鸡菊遗传多样性指数为0.281 1，大于同科药用菊花(PPB=81.87%，H=0.219 1)[11]，有较高的遗传多样性，决定了其较强的环境适应能力，因此双色金鸡菊能够在新疆各种生态环境下引种成功。但从Nm指数来看，双色金鸡菊种群间基因交流处于较低水平，这也进一步证明了双色金鸡菊在不同环境长期引种栽培过程中遗传物质发生了区域性的遗传分化，实际表现在不同产区表型性状、气味、浸出液色度、有效成分[12-13]等方面的差异，因此导致市场上也出现了质量和外观参差不齐的雪菊产品。

在全球尺度上植物的遗传物质与纬度、气候因素之间存在显著的非线性关系[14]。在和田昆仑山地区生长的双色金鸡菊与环境相适宜，产生了适合本地区环境的遗传分化。ISSR遗传多样性分析结果表明，生长在皮山县干旱、高寒、高海拔地区的昆仑雪菊在遗传物质上显示出较强的地域性和道地性，因此，昆仑山区产的昆仑雪菊无论在品质还是价格上都长期保持着巨大的优势。虽然环境会对雪菊的品质造成一定的影响，但近些年由于盲目的人工栽培导致原始的种质与其他地区种质发生基因交流，也是造成昆仑雪菊种质混乱、品质良莠不齐的一个重要因素，因此保护昆仑雪菊原产地的种质资源对保持昆仑雪菊的市场竞争力具有重要的意义。

图3 基于ISSR的昆仑雪菊19个采集地的遗传聚类图