复方中草药制剂对克氏原螯虾生长、免疫功能及肝胰腺组织的影响

孟 愔， 胡 骞， 金玉立， 吕慧源， 顾泽茂*

（1.华中农业大学水产学院/双水双绿研究院，湖北武汉430070；2.湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心，湖北武汉430070；3.北京生泰尔科技股份有限公司/北京市中兽药工程技术研究中心，北京102600）

克氏原螯虾 （Procambarus clarkii） 俗称小龙虾， 是我国重要的淡水经济虾类。 目前克氏原螯虾养殖业普遍存在集约化程度低、 养殖技术落后等问题， 养殖中病害的发生日益频繁（农业农村部，2018）。 生产中常用化学药剂和抗生素防治克氏原螯虾病害， 但易引发环境污染及病原生物耐药性等负面效果（郝忱等，2014），不利于建立绿色生态和优质安全的克氏原螯虾养殖模式。因此，寻求安全高效的药物用于防控克氏原螯虾病害具有重要意义。

中草药制剂含有多种活性成分， 是一种绿色安全的抗生素替代物，常用作饲料添加剂，不仅可以提高养殖动物免疫功能，还具有低毒、低耐药性和环境友好等优点 （李思明等，2015；Bulfon 等，2015）。 然而，中草药制剂作为免疫增强剂存在着单一使用剂量大和成本高的局限性， 而不同种类中草药制剂组成的复方制剂， 可以促进药物之间的协同作用，进而降低使用剂量，节约成本（杜强等，2015）。甘草、板蓝根和黄芪是我国常用的中草药制剂， 有研究表明， 虾蟹类动物饲料中添加甘草、 板蓝根和黄芪多糖不仅可以显著增强动物免疫功能，还可以调节机体代谢功能，从而提高生长性能（汪多等，2017；洪徐鹏等，2013），但三者的配伍使用及对克氏原螯虾的影响鲜见报道。 因此，本研究将甘草、 板蓝根和黄芪多糖以不同配比设置3 种复方制剂添加到饲料中， 旨在筛选可以提高克氏原螯虾生长性能、 免疫功能及改善肝胰腺结构和功能的复方制剂， 以期为克氏原螯虾养殖业健康发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料及分组 试验用基础饲料购自潜江加益加水产饲料有限公司， 产品标准编号：Q/JYJ001-2016， 其主要营养成分为： 粗蛋白质≥28.0%， 粗纤维≤14.0%， 粗灰分≤18.0%， 粗脂肪≥5.0%，赖氨酸≥1.6%，钙1.0% ～4.0%，总磷1.0% ～2.5%， 氯化钠0.1% ～2.0%， 水分≤12.5%； 中草药制剂购自北京生泰尔科技股份有限公司，黄芪多糖有效成分含量为60%，其余为赋形剂；甘草、板蓝根购回后先经粗粉碎，再经超微粉碎机粉碎，过120 目筛网。将3 种中草药制剂按照比例添加到粉碎后的基础饲料中， 用膨化机制成粒径3.0 mm 的沉水性颗粒饲料。本研究通过前期预试验，并综合应用成本等因素，设计3 个试验组（A 组、B 组、C 组）和1 个对照组（N 组），每组设置3 个平行。 试验分组及复方中草药添加比例如表1 所示。

表1 试验分组及复方中草药添加剂成分

1.2 模拟生态养殖系统构建 试验场地为人工构建的12 个长宽比为3:2、面积为667 m2的模拟生态养殖池塘。试验开始前，各池塘分别栽种3 行伊乐藻，方向与池塘的长边平行，行距为5 m，每行中草团株距3 m，草团直径30 cm，重量约为1 kg；水草生根发芽后逐渐将水位加至70 cm；池塘中央及四周设置食台， 用以观察克氏原螯虾的摄食情况；检测各项水质指标稳定后，按照分组投放克氏原螯虾。

1.3 试验动物和饲养管理 克氏原螯虾购于潜江某克氏原螯虾养殖基地， 购回后放于暂养池中暂养，5 d 后转移至各试验池塘，每个池塘投放同批次、平均规格为（8.7±1.6）g 的健康克氏原螯虾3000 尾。 根据池塘分组投喂相应饲料，日投喂量为克氏原螯虾体重的3% ～5%（根据克氏原螯虾生长情况调整投喂量， 以投喂2 h 后吃完为宜），每天投喂2 次，8:00 投喂日粮的30%，19:00 投喂日粮的70%，各组日投喂量保持一致（徐增洪等，2012）。 池塘水位保持（70±5）cm，并且定期检测水质指标，保证试验期间溶氧≥6.0 mg/L，pH 为（7.3±1.2），氨氮＜0.2 mg/L，亚硝酸盐＜0.005 mg/L。试验水温为自然水温，温度为21 ～26 ℃。

1.4 样品采集与制备 试验开始后， 在第7、14、21 天和28 天采样。 在各池塘中心放置由20 目尼龙网制备的长2 m，宽20 cm，高20 cm 的笼子，每个池塘随机捕捞30 尾虾， 饥饿24 h 后， 测量体重，随后用1 mL 注射器从围心腔抽取血淋巴，置于4 ℃冰箱过夜，之后用4 ℃离心机离心（5000 r/min）10 min， 取上清液 （血清），-20 ℃冻存备用（汪多等，2017）。 随机取3 尾克氏原螯虾的肝胰腺，4%多聚甲醛固定。

1.5 指标测定 选取增重率、特定生长率和饵料系数3 个指标用以评估生长性能，计算公式为：

增重率/%=（Wt－W0）/W0×100；

特定生长率/（%/d）=（ln Wt－ln W0）/t×100；

饵料系数=FI/（Wt－W0）；

式中：W0为克氏原螯虾初始均质量，g；Wt为克氏原螯虾终末均质量，g；t 为饲喂天数，d；FI 表示每只克氏原螯虾平均摄食饲料总量。 养殖试验结束后，试验虾饥饿24 h，采用标记重捕法统计数量（Guan 等，1997），称重，计算上述指标。

选择酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）作为评估免疫功能的指标 （郝忱等，2014； 洪徐鹏等2013）。ACP、AKP 和SOD 活性使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。 ACP 以100 mL血清在37 ℃时与基质作用30 min 产生1 mg 酚为1 个酶活力单位。 SOD 以每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD 量为1 个酶活力单位。 PO 活力测量以L-DOPA 为底物（购自Sigma 公司），在96 孔酶标板中分别加入10 μL 血清与200 μL 0.1 mol/L pH 6.0 的磷酸钾缓冲液，振荡混匀后向各样品孔中加入10 μL 0.01 mol/L 的L-DOPA 溶液， 在490 nm 波长处读取吸光值，每隔5 min 读取1 次，以试验条件下OD490每分钟增加0.001 为1 个酶活力单位（Zhang 等，2012）。

肝胰腺固定48 h 后，经脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋等步骤处理后切片， 切片厚度为4 μm，组织切片用苏木精-伊红（HE）染色，中性树脂封片后显微镜 （Olympus CX21） 观察拍照 （王权等，2012）。

1.6 数据处理 数据以“平均值±标准差”形式表示， 用SPSS 20.0 软件的单因素方差法和Duncan’s 多重比较法分析与比较各组差异的显著性，差异水平为P ＜0.05。

2 结果与分析

2.1 复方中草药制剂对克氏原螯虾生长性能的影响 由表2 可知，试验组A、B、C 克氏原螯虾的终末质量显著高于对照组； 增重率较对照组分别提高了25.81%、26.67%和24.26%（P ＜0.05）；特定生长率较对照组分别提高了12.58%、14.05%和11.95%（P ＜0.05）， 并且B 组克氏原螯虾的饵料系数显著低于对照组（P ＜0.05）。3 个试验组之间克氏原螯虾的终末质量、增重率、特定生长率以及饵料系数差异不显著（P ＞0.05）。

表2 复方中草药制剂对克氏原螯虾生长性能的影响

2.2 复方中草药制剂对克氏原螯虾免疫酶活性的影响 由图1-I 可以发现， 在7 d 和14 d 时，各试验组ACP 活性差异不显著 （P ＞0.05）；21 d时， 试验组C 的ACP 活性显著高于对照组（P ＜0.05）， 但和其他两个试验组差异不显著 （P ＞0.05）；28 d 时，试验组C 的ACP 活力显著高于试验组A 和对照组（P ＜0.05）。

由图1-II 可以发现，7 d 时，试验组C 的AKP活性显著高于试验组A （P ＜0.05）， 试验组A、B和对照组差异不显著； 在14 d 和21 d 时，3 个试验组AKP 活性均显著高于对照组（P ＜0.05）；28 d 时，各组间AKP 活性差异不显著（P ＞0.05）。

由图1-III 可以发现，试验组B、C 的SOD 活性较对照组没有显著差异（P ＞0.05）。 在7 d 时，试验组A 的SOD 活性显著高于其他组 （P ＜0.05）；在14 d 和21 d 时，各组SOD 活性差异均不显著（P ＞0.05）；在28 d 时，试验组A 的SOD活性显著高于对照组（P ＜0.05）。

由图1-IV 可以发现， 试验组A 和对照组的PO 活性在试验期间基本保持不变， 而试验组B、C呈上升趋势，并且C 组的增长速度快于B 组，从14 d 开始，试验组C 的PO 活性显著高于试验组A和对照组（P ＜0.05），和试验组B 没有显著差异。

图1 复方中草药制剂对克氏原螯虾免疫相关酶活性的影响

2.3 克氏原螯虾肝胰腺组织结构 观察发现，储存细胞（R 细胞）、分泌细胞（B 细胞）和纤维细胞（F 细胞） 在克氏原螯虾的肝胰腺中较为常见，胚细胞（E 细胞）较为少见。 各组的肝小管上皮细胞结构完整， 细胞界限清晰， 未出现肝胰腺病变症状。各试验组管腔呈明显的多边形结构，对照组管腔呈椭圆形或多边形。 各试验组的B 细胞较对照组多，同时还可以观察到各组F 细胞中有被液泡包裹的棕色颗粒，并且对照组F 细胞中的棕色颗粒比试验组多。 各组R 细胞均含有丰富的脂滴，且试验组的R 细胞脂滴更致密。

3 讨论

3.1 复方中草药制剂对克氏原螯虾生长性能的影响 本研究结果表明， 饲料中添加3 种复方中草药制剂均能显著提高克氏原螯虾的增重率与特定生长率（P ＜0.05）。其原因可能是甘草和板蓝根中含有丰富的有机酸、生物碱、多糖等活性成分，可以促进动物机体消化酶的合成与分泌（谭崇桂等，2013），改善肠道微生物菌群结构（刘红柏等，2004），加快营养物质的消化吸收与利用（张耀武等，2010）。洪徐鹏等（2013）研究发现，低浓度的黄芪多糖可以提高克氏原螯虾的蜕壳频率， 而蜕壳是甲壳类动物生长和发育的标志 （Freeman 等，1990）。本研究还发现随着复方制剂中板蓝根占比的增加，克氏原螯虾的生长性能有一定提升，其中板蓝根占比最大的0.13%甘草+0.14%板蓝根+0.03%黄芪多糖组的饵料系数显著低于对照组（P＜0.05），并且增重率与特定生长率高于其他试验组， 这可能是因为板蓝根对克氏原螯虾促生长作用较强。 目前关于板蓝根对克氏原螯虾生长性能影响的研究鲜见报道。 黄永春等（2016）比较了饲料中分别添加1.5%的甘草和板蓝根的超微粉对凡纳滨对虾生长性能的影响， 发现甘草促生长作用比板蓝根强， 这可能由于中草药的配比及养殖动物的不同，药物作用的效果存在着一定差异。另一方面， 本研究中克氏原螯虾养殖试验在模拟生态养殖系统中进行，养殖环境相对复杂，而板蓝根和黄芪等可以提高养殖动物对环境的适应能力，从而减少体能消耗， 促进营养物质的积累（李明等，2008）。

3.2 复方中草药制剂对克氏原螯虾免疫功能的影响 克氏原螯虾属于无脊椎动物， 主要依赖自身的非特异性免疫功能防御病原生物 （郝忱等，2014）。酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和酚氧化酶是无脊椎动物非特异性免疫功能中4种重要的免疫因子， 它们在机体对病原的识别与清除过程中发挥重要作用， 是评估无脊椎动物免疫功能的重要指标（徐静静等，2018； 王跃斌等，2015）。中草药中的活性成分可以通过调节动物体内免疫因子的释放来改善机体免疫功能（郭爱伟等，2008）。 王芸等（2012）将黄芪、大黄、甘草和黄芩以相同比例组成复方按照1%剂量添加到饲料中投喂凡纳滨对虾28 d 发现，酚氧化酶和超氧化物歧化酶等免疫相关酶活性显著提高（P ＜0.05），弧菌攻毒7 d 后的免疫保护率可以达到91.6%。本研究中，添加0.3%复方中草药制剂的试验组克氏原螯虾免疫功能均有不同程度的提高， 并且在7 ～14 d 即可开始发挥药效。 但汪多等（2017）在凡纳滨对虾饲料中添加0.3%的黄芪多糖、 黄柏、苦参、大黄等构成的中草药复方，投喂42 d 发现，机体免疫相关酶活性没有明显提高。 这可能与中草药配比及养殖动物的不同有关，并且甘草、板蓝根和黄芪多糖之间具有一定的协同作用。此外，本研究还发现不同配比的试验组之间免疫相关酶活性也存在一定差异， 其中甘草占比最大的0.21%甘草+0.06%板蓝根+0.03%黄芪多糖的试验组克氏原螯虾4 种免疫相关酶活性均得到明显提高，并且酸性磷酸酶、 碱性磷酸酶和酚氧化酶显著高于对照组（P ＜0.05）， 试验期间呈稳定增长的趋势， 这可能是由于复方制剂中甘草对克氏原螯虾免疫功能的提高起主导作用， 其作用机理及最佳配比值得进一步的研究。

3.3 复方中草药制剂对克氏原螯虾肝胰腺组织结构的影响 肝胰腺是克氏原螯虾重要的代谢器官，主要发挥消化、吸收、储存和排泄等功能（Wei等，2011）。 虾类的肝胰腺由多级分支的肝小管构成， 肝小管由基膜和位于基膜上的单层柱状上皮细胞构成。其中肝小管上皮细胞主要分为四类，分别为胚细胞（E 细胞）、储存细胞（R 细胞）、分泌细胞 （B 细胞） 和纤维细胞 （F 细胞）（Loizzi 等，1971）。 其中，E 细胞的功能是分裂和分化为其他类型的肝胰腺细胞；R 细胞主要功能为吸收和储存营养物质；B 细胞发挥分泌消化酶及胞内消化作用；F 细胞发挥吸收转运以及合成蛋白质的作用（李军涛等，2018；梁华芳等，2011）。本研究观察到各组克氏原螯虾R 细胞中均含有丰富的脂滴，表明试验期间饲料的营养成分可以满足克氏原螯虾的营养需求（魏克强等，2010）。使用复方中草药添加剂的试验组克氏原螯虾的肝小管管腔多边形结构较对照组更明显， 这种变化增加了肝胰腺组织细胞和管腔的接触面积， 推测这种改变可以提高上皮细胞和肝小管之间的物质交换效率。此外，本研究发现试验组克氏原螯虾肝小管中B 细胞的占比大于对照组， 其数量增加标志着肝胰腺和肠道消化吸收能力的增强， 这与李军涛等（2018）研究结果相似。 本研究还发现各组中的部分F 细胞中存在着液泡包裹的棕色物质， 并且试验组含有棕色物质的F 细胞较对照组占比少，推测可能是添加的复方中草药制剂可以提高F 细胞的物质转运功能， 使得试验组F 细胞中棕色物质较少。

4 结论

饲料中添加甘草、板蓝根、黄芪多糖构成的复方中草药制剂可以显著提高克氏原螯虾生长性能和免疫功能，改善肝胰腺组织结构和功能。并且不同的药物配比效果不尽相同， 其中0.13%甘草+0.14%板蓝根+0.03%黄芪多糖可以获得较好的生长性能，0.21%甘草+0.06%板蓝根+0.03%黄芪多糖对克氏原螯虾免疫功能提升效果较好， 各复方组均能改善肝胰腺组织结构和功能。