致病菌检验和鉴定技术在食品安全保障中的应用

□ 赵德锟 张帆 杭州大微生物技术有限公司

□李杜娟 郑州市食品药品检验所

食源性致病菌污染是影响食品安全的重要因素，随着人们生活水平的提升，以及对检验能力要求的提高，致病菌检验与鉴定已成为食品安全检测实验室中最基本且重要的工作之一。采用恰当的鉴定手段，及时、准确地鉴定出食品样品中的疑似致病菌是保证食品安全的关键，也是国家监管部门和企业实验室中检验工作者共同努力的方向。本文分析了食源性致病微生物鉴定的两类主流技术，提出生化鉴定方法和经法规标准确认的微生物鉴定金标准。最终显示，食品安全检测实验室采用自动微生物生化鉴定系统，有助于降低致病菌污染风险，促进食品安全保障体系的健全。

1 致病菌检验和鉴定技术在食品安全保障中的重要性

食品安全一直是我国重大的公共卫生问题，随着人们生活水平的不断提高，微生物对食品的污染问题也愈发受到关注。其中，食源性致病菌污染是影响食品安全的重要因素，其在食品生产、加工、储存和运输等环节中均有存在的可能。消费者一旦误食被食源性致病菌污染的食品，极易引起食物中毒，还易导致各类食源性疾病的发生，严重时甚至危及生命。同样，食品生产企业一旦发现其产品被食源性致病菌污染，将会受到产品召回、停产、整顿及罚款等处罚而承担重大的经济损失。2019年，国家市场监督管理总局颁布新规—《食品安全抽样检验管理办法》，要求食品生产经营者收到市场监管部门的致病菌检验项目不合格的通报后，应当立即封存不合格食品，暂停生产、经营，并召回已销售的不合格食品；涉嫌犯罪的，依法及时移送公安机关。因此，及时、准确地检测和鉴定出食品样品中的疑似致病菌，是将风险降至最低以保证食品安全的关键，也是国家监管部门和食品企业实验室中微生物检验工作者努力的方向。

目前，我国GB 4789食品安全系列标准和国家食源性致病菌监测目录中，大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、霍乱弧菌、副溶血性菌及空肠弯曲菌等均属于被要求检验的致病菌。除此之外，还有其他相关法律法规也对食品中食源性致病菌的定性检查提出了明确要求，如表1、表2所示。根据食品安全国家标准的规定，在食源性病原菌检测过程中，若检测结果呈阳性，则需采用生化试验或微生物生化鉴定系统进行相关的鉴定以确定其属、种。因此，近年来微生物鉴定技术也逐渐成为食品安全检测实验室亟需加强的重要技术能力之一。

表1 国家法规对食源性致病菌检验和鉴定的要求

2 食源性致病微生物鉴定的主流技术及应用特点

关于食源性致病微生物鉴定的主流技术主要分为两类，即常规鉴定技术和分子水平鉴定技术。

微生物常规鉴定技术是根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对微生物进行形态学和生理生化水平的分类及鉴定。由于部分微生物形态比较单一而容易分辨，可根据其形态直接判断。虽然大部分微生物形态较为相近，但由于其具有不同的酶系统，且对营养基质的分解能力也有所不同，因此可在形态学观察的基础上，通过微生物细胞壁组成、发酵产物、代谢情况、对碳源或氮源等营养成分利用的生化反应进行综合判断，进而实现分类和鉴定。

分子水平鉴定技术主要包括蛋白质检测和DNA检测。当前，蛋白质的鉴定技术主要利用飞行时间质谱获得微生物特征蛋白质分子的“指纹图谱”，之后通过数据库比对来实现；DNA检测的鉴定技术则是利用细菌核糖体上的16SrDNA基因进化速度缓慢的特点，通过检测同源基因来实现，现常用的手段包括16SrDNA测序、PFGE（脉冲场凝胶电泳）和全基因组测序等技术。

从当前的应用情况来看，两类微生物鉴定技术各有优劣。分子鉴定技术虽然快速、通量高、鉴定结果准确，但样品前处理过程和结果分析过程对操作人员的要求较高，且仪器价格昂贵、一次性投入较大，因此暂未被纳入食品安全检测标准中。生化鉴定方法虽然鉴定时间较长，但因操作流程标准化、结果分析难度低、鉴定准确性较高，且能直接反应出微生物的生化特性，因此该方法一直被全球许多国家确认为是法规标准中的微生物鉴定金标准，是不可替代的实验室主流鉴定技术之一。

3 DW-M80自动微生物生化鉴定系统

为实现对食品终产品检测和加工过程监控中采样的细菌、酵母菌等微生物进行便捷、可靠的菌种鉴定，杭州大微生物技术有限公司结合多年工业微生物检测方面的经验和技术积累，推出了DW-M80自动微生物生化鉴定系统，如图1所示。通过一系列突破性创新，该系统除操作更加方便且人性化外，还优化和扩大了微生物数据库，具有简便的操作流程和高效准确的鉴定能力，不仅适用于各种类型样品（食品、农产品、药品、化妆品、质控样、模拟样品及环境监测样品等）的微生物鉴定，还适用于市场监督管理部门、海关出入境检验检疫、疾病预防控制、食品安全、制药、企业、兽医、渔业水产养殖等微生物检测实验室。

3.1 工作原理

DW-M80自动微生物生化鉴定系统利用不同细菌具有不同酶系统的特点和对底物的不同分解能力，以生化反应原理（底物反应、糖利用反应、同化反应、氨基酸实验等）为基础，通过微生物激光透射比色法捕获细菌的生化表型特征，并采用数值分类原理，自动比对专用微生物数据库，对各种类型样品的微生物单分离株进行自动分类和鉴定。

3.2 系统特点

3.2.1 操作方便简单，结果准确可靠

工作流程可实现标准化，仅需4步（革兰氏染色与镜检→试剂板选择→加样及培养→上机自动鉴定）即可完成鉴定全流程；实验结果无需人工干预，可全部由计算机自动完成判读，并调取数据库信息，得出鉴定结果。同时，由于DW-M80自动微生物生化鉴定系统将多个生化反应有效整合并浓缩于96孔板卡上，不仅增加了生化反应数量，还实现了微量培养与检测，在检测准确性和速度上都得到大幅提高，最快可当天获得结果。

3.2.2 拥有广泛的鉴定范围

微生物鉴定试剂板是根据不同种类微生物专门设计而成，为更大程度地扩大鉴定范围，DW-M80自动微生物生化鉴定系统配套16种鉴定板条，鉴定范围覆盖绝大多数微生物，适用于肠杆菌、非发酵菌、葡萄球菌、肠球菌、链球菌、阳性杆菌、弧菌、阴性球菌、酵母菌、嗜血杆菌、厌氧菌、弯曲杆菌、支原体、分枝杆菌等微生物的检测。

3.2.3 提供庞大的专业数据库支撑

数据库是鉴定系统能否准确鉴定细菌的关键因素，DW-M80自动微生物生化鉴定系统的菌种信息数据库在2000种以上，可定性鉴定微生物数量为550种以上；当发现数据库以外的未知少见菌种时，还可结合实验室需求进行菌种信息和生化反应表型的人工扩充，进而使数据库不断丰富和完善。

图1 DW-M80自动微生物生化鉴定系统

基于以上特点，DW-M80自动微生物生化鉴定系统已经成为食品检测实验室中微生物检测的日常鉴定手段。除微生物生化鉴定功能外，该系统还可实现微生物对抗生素耐药性的检测及MIC值测定，满足抑菌实验的需求。

4 结语与展望

近年来，随着仪器分析技术的不断进步，自动化微生物鉴定技术逐步发展起来，大大促进了食品检测技术的发展进程，并正被广泛应用于致病菌的检测和鉴别中。由于自动微生物生化鉴定系统采用经典的微生物生理生化反应原理，具有操作简单、标准化、准确率高等特点，现阶段仍是食物样品中微生物鉴定的基本方法，也是分子鉴定结果的根本验证手段。

此外，若食品生产单位能有效使用微生物生化鉴定系统，对生产环境、生产过程，以及出厂最终产品进行有效监控，了解微生物分布情况，及时分析微生物污染来源等，有助于降低微生物污染风险，促进产品质量安全保障体系的健全。

表2 食品安全检测实验室的致病菌鉴定项目需求与标准依据