脂联素抑制糖尿病小鼠结直肠癌生长转移及机制研究

李鑫 徐洁 潘月龙

肥胖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗已被认为是结直肠癌及腺瘤的重要危险因素。胰岛素/胰岛素受体通路的过度激活能促进有丝分裂和血管生成，是结肠癌发生的早期步骤[1]。脂联素是一种主要由白色脂肪组织分泌的244 个氨基酸的蛋白质，参与糖代谢和脂肪代谢，具有改善胰岛素抵抗、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用。体内的循环脂联素水平还与患恶性肿瘤呈负相关，相关Meta 分析结果提示脂联素在结直肠癌及腺瘤患者中的水平低于正常健康人[2-4]。Sugiyamai 等[5]通过分子生物学实验证实脂联素通过活化磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMPK），进而下调哺乳动物雷帕霉素标靶信号通路（mTOR），从而起到诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤细胞生长的作用。以往的研究表明，脂联素在结直肠癌发生、发展中起到重要的作用[6-8]。脂联素是否可以通过改善糖代谢、胰岛素抵抗等抑制结直肠癌肿瘤生长和转移目前尚缺乏相关实验研究。为此，笔者设计本实验，探讨脂联素对糖尿病相关结直肠癌的影响，分析相关通路变化，以期明确脂联素对肿瘤抑制的作用靶点和分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物和细胞株 4 周龄的雌性糖尿病小鼠（美国B6.V-Lepob/OlaHsd Harlan 实验室）、小鼠结直肠癌细胞株MCA38（浙江大学肿瘤研究所）。

1.2 主要试剂及设备 小鼠重组脂联素（北京康肽生物科技有限公司），胰酶、FBS、青霉素、链霉素、DMEM培养基（美国Hyclone 公司），细胞恒温培养箱（上海Healforce 公司），ELISA 试剂盒（美国ALPCO Diagnostics 公司），强生单键血糖仪（美国强生公司），TNF-α 试剂盒（上海欣博盛公司，EMC102a.48），IL-6 试剂盒（上海欣博盛公司，EMC004.48），IL-1β 试剂盒（上海欣博盛公司，EMC001b），XDS-500C 型显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司），5702R 型低速离心机（德国Eppendorf公司），Ras 抗体（上海abcam 公司，ab52939），β-actin抗体（美国Proteintech 公司，60008-1-Ig），胰岛素生长因子受体-2（IGF-2R）抗体（美国Proteintech 公司，20253-1-AP），c-Myc 抗体（美国Proteintech 公司，10057-1-AP），β-catenin 抗体（美国Proteintech 公司，51067-2-AP），过氧化物酶体增殖剂激活受体抗体γ（PPAR γ）抗体（美国Proteintech 公司，16643-1-AP），p21 活化激酶-1（PAK-1）抗体（美国Proteintech 公司，21401-1-AP），山羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（上海碧云天公司，A0208），PBS（上海长岛抗体诊断试剂公司，FL-2004），过硫酸铵（北京solarbio 公司，A8090），十二烷基硫酸钠（SDS）（北京solarbio 公司，S8010），Tris（北京solarbio 公司，T8060），Tween-20（美国Amresco 公司，BYL40713），miniprotean3 cell 型电泳仪（上海BIO-RAD 公司）。

1.3 动物分组 将糖尿病小鼠按照随机数字表法分成以下4 组（每组8 只）：皮下成瘤治疗（SA）组：皮下成瘤+小鼠重组脂联素；皮下成瘤对照（SC）组：皮下成瘤+0.9%氯化钠溶液；肝转移治疗（LA）组：肝转移+小鼠重组脂联素；肝转移对照（LC）组：肝转移+0.9%氯化钠溶液。按组别分别向小鼠腹腔注射小鼠重组脂联素（5μg/d）或0.9%氯化钠溶液至脊髓脱臼法处死。

1.4 动物实验 依据相关研究，通过注射MCA38 细胞构建结直肠癌皮下成瘤、肝转移模型[9-10]。将小鼠结直肠癌细胞株MCA38 培养在含10%的FBS、100U/ml 的青霉素和100U/ml 的链霉素的DMEM 培养基中，并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱内。培养至指数生长期（约24h）后，制成单细胞悬液（浓度为5×107/ml）。按组别开始注射7d 后，SA 组、SC 组小鼠前肢腋下皮下注射MCA38 细胞悬液100μl，继续饲养28d 后处死；LA 组、LC 组小鼠用戊巴比妥钠麻醉后仰卧固定，皮肤消毒后取左侧肋下切口，逐层进腹后暴露脾脏并游离至体腔外，MCA38 细胞悬液100μl 缓慢于脾脏包膜下注入，5min 后结扎脾门并摘除小鼠脾脏，止血后关腹，继续饲养42d 后处死。

1.5 肿瘤体积及转移性结节记录 SA 组、SC 组小鼠待局部成瘤后每隔3d 测量长径和短径计算肿瘤体积；LA组、LC 组小鼠处死后取出肝脏，计数转移性结节个数。

1.6 糖尿病相关指标的检测 采用ELISA 法。分别在SA 组、SC 组小鼠重组脂联素或0.9%氯化钠溶液注射前（第0 天）、皮下肿瘤注射前（第7 天）、肿瘤接种后（第14、21 天）、小鼠处死前（第28 天），或LA 组、LC 组小鼠重组脂联素或0.9%氯化钠注射液注射前（第0 天）、皮下肿瘤注射前（第7 天）、肿瘤接种后（第14、21、28、35天）、小鼠处死前（第42 天），小鼠尾静脉取血，采用血糖仪检测血糖浓度，检测前小鼠空腹12h。使用ELISA 试剂盒检测4 组小鼠处死前血液中糖尿病相关指标脂联素（adiponectin，ADPN）、瘦素（Leptin）、IGF-1、胰岛素（Insulin）浓度的变化。

1.7 炎症相关标志物水平的检测 采用ELISA 法。使用Th1/Th29-plex assay 超敏试剂盒测试小鼠处死前血液中炎症相关标志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的浓度变化。

1.8 肿瘤组织病理学检查及相关通路蛋白水平的检测 所有小鼠处死后，肿瘤组织部分以10%中性甲醛溶液固定继续病理切片观察。采用Western blot 法检测肿瘤组织中肿瘤相关通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 表达水平的变化。

1.9 统计学处理 采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以表示，多组间两两比较采用LSD-t法。采用GraphPad Prism 6 软件对实验数据进行相关图片的绘制。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4 组小鼠肿瘤体积及转移性结节的比较 造模成功后12d 时SA 组、SC 组小鼠肿瘤体积比较差异无统计学意义；而16、20、24、28d 时，SA 组小鼠肿瘤体积均小于SC 组小鼠，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。LA 组小鼠转移性结节数平均为（5.4 1.34）个，与LC组（2.2 0.84）个比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。肝组织形态见图1（插页）。

图1 肝组织形态（A 为LC 组，B 为LA 组）

表1 不同时间SA 组、SC 组小鼠肿瘤体积的比较（mm3）

2.2 4 组小鼠血糖浓度及ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 浓度的比较 随着时间的增加，尤其14d 以后，相比SC 组、LC 组，SA 组和LA 组的小鼠血糖浓度均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图2、3；SA 组和LA 组小鼠ADPN 浓度均明显升高，Leptin、IGF-1 及Insulin 浓度均降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表2。

图2 不同时间SC 组和SA 组小鼠血糖浓度（与SC 组比较，**P＜0.01）

图3 不同时间LC 组和LA 组小鼠血糖浓度（与LC 组比较，**P＜0.01）

表2 4 组小鼠ADPN、Leptin、IGF-1 及Insulin 浓度的比较

2.3 4 组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 浓度的比较 相较于SC 组及LC 组，SA 组、LA 组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 浓度均明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表3。

表3 4 组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 浓度的比较

2.4 4 组小鼠肿瘤组织病理变化 HE 染色下，SC 组中，肿瘤细胞核大深染，核分裂现象较多，细胞排列紧密、规整；SA 组可见肿瘤细胞有所减少，细胞排列疏松、大小不一，并出现坏死组织，见图4（插页）。LC 组中，肿瘤细胞分化差，异型性明显，胞质少，核大深染且不规则，核分裂象易见；LA 组可见肿瘤细胞减少，核分裂象减少，出现组织坏死情况，见图5（插页）。

图4 肿瘤组织病理变化（a-b:SC 组；c-d:SA 组；HE 染色，×200）

图5 肿瘤组织病理变化（a-b:LC 组；c-d:LA 组；HE 染色，×200）

2.5 4 组小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 表达水平的比较 SA 组、LA 组小鼠IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPARγ 及PAK-1 表达水平较SC 组及LC 组均下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图6、7、8。

图6 各组基因蛋白表达电泳图（A：SC 组；B：SA 组；C：LC 组；D：LA 组）

图7 SC 组与SA 组肿瘤相关通路蛋白表达的比较（与SC 组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

图8 LC 组与LA 组肿瘤相关通路蛋白表达的比较（与LC 组比较，*P＜0.05）

3 讨论

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，随着化疗药物、靶向治疗药物的进步和多学科协作治疗的发展，使得疗效有了明显的提高，但肿瘤的侵袭和转移仍是治疗失败的主要原因[11]。结直肠癌在所有恶性肿瘤中发病数居第3 位，死亡数亦高居第3 位[12]。流行病学研究表明，糖尿病患者发生乳腺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌等恶性肿瘤的风险明显高于正常人。相较于普通人群，2 型糖尿病患者罹患结直肠癌的风险增加了高达3 倍[13]。高胰岛素血症和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）在结肠细胞代谢、细胞生长、增殖和调节细胞凋亡等过程中发挥了重要作用[14-16]。胰岛素水平和IGF-1 水平的升高可激活Ras 信号途径，促进结肠细胞的增殖，导致一种生存优势，从而诱发结直肠癌的发生[17]。

脂联素是近年发现的一种主要由白色脂肪组织分泌的重要因子，参与糖代谢和脂肪代谢，能改善胰岛素抵抗。Awazawa 等[18]发现脂联素可通过IL-6 依赖的方式激活信号转导及转录活化因子3，上调肝脏胰岛素受体底物2 的表达，增强胰岛素敏感性。现有研究显示脂联素在肿瘤的发生发展中也起着重要作用，主要通过以下机制发挥抗肿瘤作用：首先，它可以通过刺激受体介导的信号传导通路直接作用于癌细胞，如AMPK，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K / AKt)。其次，它可以通过调节靶部位的胰岛素敏感性，调节炎症反应和影响肿瘤血管生成来间接起作用[19-20]。本实验中通过动物实验，探讨脂联素对糖尿病相关结直肠癌的影响，分析相关通路变化，明确脂联素对肿瘤抑制的作用靶点和分子机制。本实验结果表明在糖尿病小鼠中，脂联素能够抑制瘤体的生长，对癌细胞的转移有一定抑制作用。通过比较有无脂联素作用小鼠的血糖浓度、糖尿病相关标志物、炎症相关标志物、病理变化及肿瘤相关通路蛋白的变化，提示了脂联素能通过降低血糖，上调糖尿病相关标志物ADPN 浓度和降低Leptin、IGF-1 及Insulin 浓度，降低炎症相关标志物TNF-α、IL-6、IL-1β浓度，下调肿瘤相关通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、βcatenin、PPAR γ 及PAK-1 的表达从而影响肿瘤的生长和转移。

综上所述，本研究表明脂联素能抑制糖尿病相关结直肠癌的生长和转移，主要机制可能与降低Leptin、IGF-1、Insulin 浓度以改善胰岛素抵抗，降低血糖，降低炎症相关标志物TNF-α、IL-6、IL-1β 的浓度，下调肿瘤相关通路蛋白IGF-2R、Ras、c-Myc、β-catenin、PPAR γ及PAK-1 的表达有关。