非编码RNA在乳腺癌上皮间质转化中的相关研究

闫 雷，陈昌杰，杨清玲

乳腺癌是女性中常见的恶性肿瘤之一，手术治疗是目前主要的治疗手段，但乳腺癌具有转移性和侵袭性，患者很容易再次复发。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是由EMT激活转录因子执行的，向肿瘤细胞提供侵袭力和运动特性的关键过程，是乳腺癌转移和耐药的主要原因。非编码RNA (non-coding RNA,ncRNA)是指一类不具有指导蛋白质合成功能的RNA，包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)以及环状RNA(circular RNA,circRNA)等，这些非编码RNA通常在转录水平以及转录后水平参与肿瘤基因的表观遗传调控[1]。研究[2]证实ncRNA可以作为肿瘤抑制因子调控肿瘤基因的表达水平，其通过对肿瘤基因的调控作用抑制EMT进展可能会成为治疗乳腺癌的关键环节。本文对目前较受关注的三类ncRNA与乳腺癌EMT相关研究进行汇总，以期为乳腺癌的治疗探寻新的靶标和思路。

1 miRNA与乳腺癌EMT

EMT的发生是肿瘤侵袭的重要途径，是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞或基质细胞表达的许多分子，其中一个重要的调控分子是miRNA[3]。miRNA是从较长RNA转录体的茎环区加工而来的长度在22 nt左右的内源性非编码RNA，在不同的真核生物系中直接对靶基因进行转录后抑制[4]。

研究[5]发现miRNA在乳腺癌EMT以及EMT相关耐药机制中发挥关键作用。 IMANI等[6]研究表明微小RNA-34a(miR-34a)能够通过调控NOTCH家族相关蛋白(Notch homolog 1,NOTCH1)、TWIST相关蛋白(Twist-related protein 1,TWIST1)和E盒结合锌指蛋白(zinc-finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)等转录因子的3′非翻译区使EMT信号通路失活。此外，过表达miR-34a能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。KONG等[7]研究发现过表达miR-3178能够抑制三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)细胞的增殖、迁移以及EMT形成。此外，双荧光素酶报告实验证实NOTCH1是miR-3178的直接靶基因，实时定量聚合酶链式反应(quantitative real time poly-merase chain reaction,qRT-PCR)和免疫印迹实验(Western blotting)表明miR-3178通过靶向调控NOTCH1表达，从而抑制乳腺癌EMT形成。XIANG等[8]研究表明，巨核母细胞白血病/肌钙素样1(megakaryoblastic leukemia/myocardin-like1,MKL-1)和信号转导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT 3)通过启动子CArG box促进波形蛋白的表达。体外实验证明MKL-1和STAT 3的协同作用诱导MCF-7细胞系发生EMT。荧光素酶报告实验表明miR-93-5p能够作用于MKL-1和STAT 3的3′非翻译区，从而抑制乳腺癌EMT的形成。CHEN等[9]应用四甲基偶氮唑盐法、划痕实验等体外实验发现，上调miR-199a-5p能够抑制乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖和创伤愈合能力，并能下调EMT相关基因表达。裸鼠成瘤实验进一步证明过表达miR-199a-5p能够抑制移植肿瘤的生长。CAI等[10]报道了在表达miR-374a的转移性乳腺癌细胞中，Wnt/β-catenin信号通路活性升高。Western blotting和荧光素酶报告实验证明miR-374a直接靶向抑制Wnt/β-catenin信号级联的多个负调控因子，包括WIF 1、PTEN和Wnt5A，表明miR-374a维持Wnt/β-catenin信号通路是促进乳腺癌转移的重要过程，miR-374a可能会成为早期乳腺癌的治疗靶点。这些研究表明miRNA能够调控如NOTCH1、TWIST1、ZEB1、MKL-1和STAT 3等转录因子的3′非翻译区使EMT相关信号通路失活；也可作用于某些信号通路如Wnt/β-catenin或通路级联的负调控因子如WIF 1、PTEN和Wnt5A等调控乳腺癌EMT。

以上研究表明,miRNA在乳腺癌细胞的转移、侵袭以及EMT机制中发挥重要调控作用。随着科研工作者们对miRNA调控EMT机制的不断探索，相信miRNA将会成为诊断乳腺癌的新的标志物和潜在治疗靶点。

2 lncRNA与乳腺癌EMT

lncRNA是一类长度超过200 nt的ncRNA分子，分布于细胞核和细胞质中，在转录水平、转录后水平发挥重要调控作用[11]。近年来，高通量测序技术的快速发展使得越来越多的lncRNA被发现，且已成为研究的热点。lncRNA在乳腺癌EMT及耐药的研究中占据越来越重要的地位，但其与乳腺癌EMT的机制研究尚不明确。根据lncRNA在乳腺癌EMT中的作用，可将其分为致癌lncRNA和抑癌lncRNA两大类。以下主要介绍几种与乳腺癌EMT相关的lncRNA，通过探究其在乳腺癌EMT中的作用机制，为乳腺癌的治疗探寻潜在的分子靶点。

2.1 致癌lncRNA与乳腺癌EMT 已有研究[12-13]证实lncRNA H19对肿瘤的生长调控发挥重要作用。转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是诱导肿瘤EMT的主要影响因子，研究[14]发现在TGF-β诱导的EMT多重耐药模型中H19的表达会升高，并且高表达出现在常见转移部位。RICHARDS等[15]研究发现lncRNA HIT(HOXA transcript induced by TGF-β)通过抑制TGF-β表达从而抑制肿瘤EMT，提示lncRNA HIT很有可能成为乳腺癌EMT的治疗靶点。XIAO等[16]发现敲除乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的lncRNA UCA1(urothelial carcinoma-associated 1)后，该细胞系上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)表达明显增加，而β-链蛋白(β-catenin)表达下降，表明lncRNA UCA1能够参与乳腺癌EMT的进展。

此外，lncRNA也可以通过竞争结合miRNA调控乳腺癌EMT。KONG等[17]发现lncRNA SNHG15在乳腺癌组织和细胞系中表达明显升高。下调SNHG15的表达能够抑制乳腺癌细胞系MCF-7和BT-20的迁移、侵袭以及EMT形成。荧光素酶报告实验表明SNHG15能与miR-211-3p直接发生相互作用。证明SNHG15作为一种ceRNA能竞争结合miR-211-3p促进乳腺癌EMT的进展。已证实肿瘤转移的病理生理过程是由癌细胞的动态可塑性所介导的，EMT和间质上皮转化的相互转换使得肿瘤在上皮和间质表型之间进行转移[18]。ZHOU等[18]通过建立小鼠自发转移性乳腺癌模型，发现lncRNA H19能够调控miR-200b/c靶点Git 2和Cyth 3的表达，表达产物是一种鸟苷三磷酸酶，能够促进乳腺癌EMT相关细胞迁移。LI等[19]研究发现，lncRNA NEAT1与miR-211之间能够相互抑制，并且miR-211的下游靶标HMGA2是EMT的诱导剂，证明lncRNA NEAT1通过调节miR-211/HMGA2轴诱导乳腺癌EMT。

近年来，随着生物信息技术的迅速发展，越来越多的lncRNA被发现参与乳腺癌EMT的形成，如PTAR等[20-21]，这些致癌lncRNA与乳腺癌EMT的发生发展有着密切关系。此外，科学家们还发现许多在乳腺癌EMT进展中发挥抑制作用的lncRNA。

2.2 抑癌lncRNA与乳腺癌EMT 目前，抑癌lncRNA作为调控乳腺癌EMT的研究热点，为今后乳腺癌治疗探寻新的分子靶标提供方向。WANG等[22]研究发现，lncRNA-CTD-2108O9.1在乳腺癌组织和细胞中表达下调，表明lncRNA-CTD-2108O9.1通过靶向白血病抑制因子受体抑制乳腺癌转移。qRT-PCR和Western blotting结果显示过表达lncRNA-CTD-2108O9.1也能直接抑制Vimentin、β-catenin表达，进而拮抗乳腺癌EMT形成。DING等[23]应用qRT-PCR技术对36例乳腺癌组织标本中lncRNA GAS5表达进行定量分析，相比癌旁组织GAS5在乳腺癌组织中表达下调，且低表达GAS5与乳腺癌TNM分期和淋巴结转移有关，干扰GAS5表达能促进乳腺癌细胞发生EMT表型改变。EZH2是一种重要的表观遗传调控因子，它能够催化组蛋白H3的lys-27三甲基化，抑制靶基因的转录。LI等[24]研究发现EZH2在包括乳腺癌在内的许多实体肿瘤中均有高表达，并且能诱导肿瘤EMT。lncRNA ANCR能够增强CDK1-EZH2的相互作用，从而促进EZH2泛素化，导致EZH2降解，肿瘤转移受到抑制。TGF-β1能够通过增加ANCR启动子区HDAC3的富集而下调ANCR的表达，降低ANCR启动子的H3和H4乙酰化。通过Western blotting和Transwell检测发现，ANCR通过下调Runt相关转录因子2(the runt-related transcription factors 2，RUNX2)的表达抑制TGF-β1诱导EMT形成，证明ANCR参与调控TGF-β1诱导EMT中的一个重要过程[25]。以上研究结果，表明ANCR有望在乳腺癌的诊断和预后中成为新的标志物和治疗靶点。

近年来，科研工作者们发现抑癌lncRNA也可以通过ceRNA机制抑制乳腺癌EMT。LI等[26]应用qRT-PCR和荧光素酶报告实验发现GAS5与miR-196A-5p存在结构互补序列，过表达GAS5能够部分削弱miR-196A-5p引起的乳腺癌细胞侵袭作用，证实GAS5能够竞争结合miR-196A-5p抑制TNBC的进展。SHI等[27]研究发现过表达lncRNA PTENP1能抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭以及集落形成能力。荧光素酶报告实验表明PTENP1能够通过ceRNA机制作用于miR-19b的3′非翻译区，并通过PTEN-PI3K/Akt信号通路参与乳腺癌细胞的迁移、侵袭以及EMT的形成。以上研究表明lncRNA能够通过调控E-cadherin、Vimentin、Snail等EMT相关标志蛋白的表达参与乳腺癌EMT；也能通过ceRNA机制竞争结合miRNA参与调控PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信号通路影响乳腺癌EMT的进展。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，越来越多的lncRNA相继被发现，相信未来lncRNA能够成为治疗乳腺癌的新型分子靶标。

3 circRNA与乳腺癌EMT

circRNA存在于自然界各种生物细胞中，由几百个至几千个核苷酸组成。与一般线性RNA结构不同，circRNA是共价闭合环路所形成的环状结构，由3′和5′(头对尾)末端共价结合形成，不受核酸酶降解的影响，因此具有很强的稳定性[28]。早期认为circRNA是基因表达的副产物，没有生物学功能，目前已有大量研究[29-30]证实，circRNA能通过与miRNA或其他分子结合，在转录和转录后水平介导基因表达。近年来研究[31]发现，circRNA在乳腺癌进展中发挥重要调控功能，但其在乳腺癌EMT中的作用机制还在探索当中。

LIAO等[32]于2017年首次报告了circRNA在乳腺癌EMT进展中发生变化，对TGF-β诱导乳腺癌EMT模型中的circRNA进行全转录组特异性RNA测序分析，发现约570种circRNA在乳腺癌EMT进程中至少发生2倍变化，表明这些circRNA可能参与乳腺癌EMT的调控。尽管有大量circRNA被报道出在各种转换细胞中均被表达，但对它们的功能和调控方式还不清楚。YAN等[33]研究发现circVRK 1能抑制乳腺癌干细胞的扩张和自我更新能力，通过利用生物信息学方法构建circRNA/miRNA网络，证实circVRK 1可能作为ceRNA竞争结合miRNA，对乳腺癌干细胞的生长进行调控。LIANG等[34]应用功能丧失实验敲除circ-ABCB10后发现乳腺癌细胞增殖能力受到抑制。生物信息学预测软件和荧光素酶报告实验证明circ-ABCB10和miR-1271之间存在互补序列。补救实验发现miR-1271能够恢复circ-ABCB10对乳腺癌细胞的生物学功能，证实circ-ABCB10可以作为ceRNA竞争结合miR-1271参与调控乳腺癌增殖、迁移以及EMT。ZHOU等[35]研究发现下调hsa_circ_0011946的表达能够抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。生物信息学软件分析预测hsa_circ_0011946能够结合miR- 26a/b并直接作用于复制因子c亚基3(replication factor C subunit 3，RFC3)，证明hsa_circ_0011946能通过miR-26a/b-RFC3轴参与乳腺癌迁移、侵袭以及EMT形成。体外实验证明miR-7能作用于PI3K/ATK和Raf/MEK/ERK信号通路抑制HER2介导的乳腺癌，并且能够逆转乳腺癌耐药。ZHAO等[36]研究发现miR-7的环状RNA海绵(circular RNA sponge for miR-7，ciRS-7)不仅能通过“miRNA海绵”作用参与miR-7的表达调控诱导乳腺癌EMT，ciRS-7还可能具有潜在的RNA干扰(RNA interference,RNAi)功能，通过RNAi作用机制导致基因沉默从而诱导乳腺癌EMT形成。重建circRNA-miRNA之间的平衡可能会对乳腺癌EMT的治疗提供新的思路。

以上研究表明，circRNA能够通过ceRNA机制竞争结合miRNA参与调控乳腺癌EMT，也能发挥RNAi功能导致基因沉默诱导乳腺癌EMT形成。学者们对circRNA的研究为乳腺癌EMT的发病机制提供新的认识，相信随着分子生物学的不断发展，circRNA在乳腺癌中的作用机制会不断被阐明，未来circRNA可能会成为诊断乳腺癌EMT新的标志物和分子治疗靶点。

4 小结与展望

EMT是一个多基因参与的复杂生物学过程，在乳腺癌转移和耐药中发挥重要调控作用，ncRNA调控乳腺癌EMT研究成果令人瞩目，但其具体机制亟待阐明。ceRNA调控网络作为一种全新的基因表达调控模式，突显出ncRNA的协同作用在调控EMT进展中的重要性，为科研工作者们提供一个全新视角进行EMT机制研究。目前对ncRNA的研究还处于初期阶段，许多ncRNA结构和功能还不完全清楚，作用机制尚未明确，设计出有效的靶向ncRNA分子抑制乳腺癌EMT是一个有挑战性的难题。随着生物信息学和基因测序技术逐渐成熟，越来越多的ncRNA被发现且被阐明其作用机制。尽管目前对乳腺癌EMT尚未研究出有效的治疗方法，但是随着科研工作者们对ncRNA调控乳腺癌EMT机制不断探索，相信未来会研发出有效的靶向ncRNA分子，乳腺癌EMT的攻克将指日可待。