suPAR/uPAR 在SLE 患者中的表达及其与疾病活动的相关性

叶莉莉，谢波，徐云芬

（湖州市中心医院，浙江 湖州 313000）

系统性红斑狼疮（SLE）是累及多个器官多个系统的自身免疫性疾病。 狼疮性肾炎（LN）是SLE最常见的并发症之一。 可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（soluble urokinase plasminogen activating receptor，suPAR）是一种变异体，经由尿激酶型纤溶酶原激活物受体 （urokinase plasminogen activating receptor，uPAR）在蛋白酶水解后从细胞膜表面脱落形成的。 近年来，suPAR/uPAR 被认为是免疫系统激活状态的重要指标。 suPAR 已成为肿瘤、传染病、脓毒症[1-3]等多种疾病预后的一种生物标志物。 目前，关于suPAR/uPAR 在SLE 患者体内表达的研究较少。 本研究通过检测suPAR/uPAR 在SLE 患者体内的表达水平， 探讨其在SLE 发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016 年1月-2018 年11月本院SLE 患者共60 例（SLE 组），男5 例，女55 例，年龄17-50 岁，平均（34.9±9.3）岁。 患者均符合1997 年美国风湿病协会修订的SLE 诊断标准[4]。采用2000 年SLE 疾病活动性指标（SLE disease activity index，SLEDAI-2000）进行评分。 另收集同期10例体检健康者作为正常对照组， 排除患有高血压、糖尿病、风湿免疫性疾病、慢性器官障碍性疾病等，其中男1 例，女9 例，年龄25-36 岁，平均（31.0±3.5）岁。 60 例SLE 患者中有20 例行肾穿刺活检，确诊为LN。 正常肾组织标本收集本院肾肿瘤远离肿瘤部位至少2cm 的肾组织， 且经光镜检查肾组织无结构及病理改变。该实验经本院伦理委员会批准，且患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 分组 SLE 组60 例按红斑狼疮活动性评分[5]再次分组：≥10 分为活动期，＜10 分为稳定期，其中活动组46 例，稳定组14 例；按有无肾脏损害分组：以尿常规出现血尿（尿红细胞数＞5 个/HP）、管型尿或蛋白尿（24 小时尿蛋白定量＞0.3g 或+++）为狼疮肾损害， 否则为狼疮非肾损害； 狼疮肾损害组34例，狼疮非肾损害组26 例

1.2.2 标本收集和检测 suPAR 的试剂盒购自ViroGates 公司， 按试剂盒说明书操作。 兔抗人uPAR 多克隆抗体购自abcom 有限公司；二抗试剂盒购自康为世纪公司； 正常山羊血清封闭液、DAB显色剂购自武汉博士德生物公司。 具体方法：清晨空腹采血2mL 置于试管中， 并收集所有研究对象的晨尿，以2700r/min 离心10 分钟，分离血浆后置于-80℃冰箱保存待检。 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血尿标本suPAR 水平。 收集肾组织，石蜡切片脱蜡、水化、抗原修复、加入一抗、二抗、显色、 脱水、 封片， 用免疫组织化学法测定肾组织uPAR，Image Pro-Plus 6.0 图像分析软件处理图片，以高倍镜下累积光密度值（IOD）代表患者肾内uPAR表达水平。同时测定研究对象的血常规、尿常规、24 小时尿蛋白定量、免疫球蛋白、补体、SLEDAI评分等。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件，计量资料以（±s）表示，组间比较采用t 检验和/或方差分析，采用Pearson 相关分析作相关性分析。

2 结果

2.1 suPAR 水平 SLE 组血清及尿液suPAR 水平均显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），详见表1。 SLE 患者中，活动组血清及尿液suPAR 水平均显著高于稳定组，狼疮肾损害组血清suPAR 水平显著高于狼疮非肾损害组， 差异均具有统计学意义（P＜0.05），而尿液suPAR 水平两组差异无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表1 两组suPAR 水平比较（±s，ng/mL）

表1 两组suPAR 水平比较（±s，ng/mL）

与正常对照组比较*P＜0.05

组别 n 血清suPAR 尿液suPAR正常对照组 10 5.41±0.72 2.49±0.50 SLE 组 60 7.70±1.11* 4.34±0.76*

表2 SLE 患者各组suPAR 水平比较（±s，ng/mL）

表2 SLE 患者各组suPAR 水平比较（±s，ng/mL）

与稳定组比较*P＜0.05；与狼疮非肾损害组比较△P＜0.05

组别 n 血清suPAR 尿液suPAR活动组 46 8.01±1.02* 4.49±0.69*稳定组 14 6.68±0.71 3.84±0.81狼疮肾损害组 34 7.99±1.08△ 4.33±0.75狼疮非肾损害组 26 7.32±1.06 4.32±0.79

2.2 suPAR 的相关性分析 Pearson 线性相关分析显示， 血清suPAR 水平与SLEDAI 评分呈正相关（r=0.44，P＜0.05）， 与补体C3、C4 呈负相关 （r=-0.26，P＜0.05；r=-0.33，P＜0.05）。尿液suPAR 水平与SLEDAI 评分呈正相关（r=0.33，P＜0.05）。 详见图1。

2.3 uPAR 在肾组织中的表达 正常肾组织标本肾小管上皮细胞中可见uPAR 少许表达， 呈浅棕色。 在LN 患者肾小管上皮细胞uPAR 表达明显增强，范围更广，在肾小球、间质炎症细胞胞浆中也可表达。与肾组织正常对照标本相比，LN 肾内uPAR IOD 显著增高（29304.20±3003.03vs10586.37±792.85，P＜0.05）。 详见图2。

3 讨论

uPAR 是一种多配体受体[6]，主要表达在巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、活化的T 淋巴细胞等细胞膜上， 同时在人体多种正常细胞膜上低表达，炎症反应、细胞因子等[7]都可刺激细胞uPAR 表达的增强，促使膜表面的uPAR 脱落释放入外周血中形成suPAR。 suPAR 在介导细胞浸润、免疫激活调节及炎症反应等方面起着重要作用。现有的研究显示，SLE 的发病机制与免疫系统失调、 免疫炎症细胞的激活等相关[8]。 激活的免疫炎症细胞刺激细胞uPAR 的高表达， 更多的suPAR 脱落至外周血中又可激活免疫炎症细胞，造成炎症失控，恶性循环，加重SLE 的发展。 本研究SLE 组血清suPAR 水平明显高于正常对照组， 证实了uPAR/suPAR 对SLE 患者的免疫调节作用。

图1 SLE 患者suPAR 水平与SLEDAI 评分、补体C3、C4 的相关性散点图。 1A：血清suPAR 水平与SLEDAI 评分的相关性；1B：尿液suPAR 水平与SLEDAI 评分的相关性；1C：血清suPAR 水平与补体C3 的相关性；1D：血清suPAR 水平与C4 的相关性。

图2 正常肾组织标本及LN 患者肾内uPAR 的表达（PV 二步法×400）。 2A：正常肾组织标本肾小管上皮细胞可见uPAR 少许表达，呈浅棕色（箭头）；2B：LN 患者肾小管上皮细胞uPAR 表达明显增强，范围更广，肾小球、肾间质炎症细胞胞浆中也可见表达，呈浅棕色（箭头）。

SLE 的病程常常是稳定期与活动期交替，稳定期SLE 患者体内的炎性细胞因子、 免疫细胞相对处于静止状态， 而活动期使更多的uPAR 表达及suPAR 的释放。 本研究活动组血suPAR 水平明显高于稳定组， 推测与活动期SLE 患者体内有更多活化的免疫炎症细胞刺激suPAR 释放有关。 临床上SLE 患者是否处于活动期常采用SLEDAI 评分、血清补体C3、C4 的水平来评估。 SLEDAI 评分越高，狼疮活动度就越高，免疫细胞的活化及细胞因子的产生随之升高。 因此， 本研究SLE 患者血清suPAR 水平与SLEDAI 评分呈正相关。 SLE 的特点之一是自身抗原清除降低、自身抗体的产生、免疫复合物的形成，从而激活体内补体系统，补体C3、C4 的激活促进免疫复合物的清除， 同时此过程需消耗大量的补体， 因而SLE 患者体内补体C3、C4水平较正常者低，临床上视补体水平的降低为SLE疾病活动的主要指标之一。有报道认为补体系统在参与免疫稳态中起着重要作用，纤溶酶是由纤溶酶原通过uPAR 激活产生的[9]，纤溶酶蛋白可以同时分裂补体C3 和C4，因此uPAR/suPAR 可能间接影响补体系统，导致炎症发生和或补体缺失。 本研究也发现， 血清suPARA 水平与补体C3、C4 水平呈负相关，提示其与疾病的活动有关。 该结果与Toldi等[10]的研究结果一致。

SLE 患者约50%～70%并发肾脏损害，LN 是SLE 预后不良的主要原因。LN 的发病机制不清，但普遍存在肾小球免疫复合物沉积的现象，使细胞因子、粘附分子浸润，导致一系列炎症级联反应，最终导致组织器官的功能障碍。 Enocsson 等[11]研究发现， 同时涉及多器官系统损害的SLE 患者其血清suPAR 水平增高更显著，以肾脏、神经损伤为甚。本研究也发现狼疮肾损害患者血清suPAR 水平较狼疮非肾损害者显著升高（P＜0.05）。 同时，SLE 组尿液suPAR 水平较正常对照组明显升高（P＜0.05），且与疾病活动性相关。其可能机制为免疫复合物在肾内的沉积激活肾脏固有细胞，使之产生多种类型的细胞因子， 募集活化免疫炎性细胞，uPAR 表达及suPAR 的释放增加使LN 患者外周血及尿液su-PAR 的水平显著升高。 本研究未发现狼疮肾损害者尿液suPAR 水平与狼疮非肾损害者的差异，这一点需要进一步研究。

LN 肾小球免疫复合物的沉积主要在肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞等处，免疫复合物的沉积触发一系列炎症反应，包括补体系统激活，炎性细胞募集，自身免疫反应扩大，导致肾脏纤维化。 本研究进一步对LN 肾穿刺组织标本行免疫组化检测，观察肾组织中uPAR 的表达情况。 结果提示，正常肾组织标本肾小管上皮细胞可见uPAR 少许表达， 而在LN 患者中肾小管上皮细胞uPAR 表达明显增强，范围更广，连肾小球、间质炎症细胞胞浆中也可见表达，提示suPAR/uPAR 参与了LN 的发病。

综上所述，suPAR/uPAR 参与了SLE 的发病，suPAR 作为SLE 生物标志物的潜力值得关注，可为SLE 的治疗提供新的思路。