催化还原-管内固相微萃取-毛细管液相色谱系统用于二硝基芘同分异构体的分析
2019-12-02李轲王昱严勇赵蕾张东堂王亚楠郭广生汪夏燕
李轲 王昱 严勇 赵蕾 张东堂 王亚楠 郭广生 汪夏燕
摘 要 构建了催化还原-管内固相微萃取-毛细管液相色谱联用（CR-IT-SPME-CLC）体系，用于3种二硝基芘（DNP）同分异构体的快速分离分析。以Pt/Al2O3为催化剂，以甲酸铵为供氢体，在95℃的条件下，采用催化氢化的方法实现了3种DNP样品的高效还原。通过优化预聚合溶液组成，利用自制的毛细管旋转装置制备了还原氧化石墨烯均匀分布且渗透性良好的纳米材料共聚管内固相微萃取整体柱。优化了固相微萃取的解析液条件，实现了3种DNP还原产物二氨基芘的高效萃取，萃取效率可达82.48%～91.65%。以粒径为5 μm的C18为填料，采用高压匀浆填充法制备了毛细管色谱填充柱，并以此构建了毛细管液相色谱-激光诱导荧光检测（CLC-LIF）系统。通过优化色谱分离条件，在10 min内实现3种二氨基芘的完全分离。本方法操作简单、快速、灵敏，适合于硝基多环芳烃中DNP同分异构体的分析。
关键词 毛细管旋转装置; 二硝基芘同分异构体; 催化还原; 管内固相微萃取; 毛细管液相色谱-激光诱导荧光检测
1 引 言
硝基多环芳烃（Nitro-PAHs）是一类持久性有机污染物[1]，主要来源于化石燃料和生物质的不完全燃烧，以及多环芳烃（PAHs）与大气介质（NO2、NO3和HNO3等）的光化学反应[2]。虽然环境中硝基多环芳烃的浓度低于多环芳烃，但其致突变性、致畸性和致癌性都是其母体多环芳烃的数十甚至数万倍[3，4]，其中含有4个芳香环的硝基多环芳烃则具有更强的毒性效应[5]，如二硝基芘（DNP）的同分异构体： 1，3-二硝基芘（1，3-DNP）、1，6-二硝基芘（1，6-DNP）和1，8-二硝基芘（1，8-DNP）等。2012年，国际癌症研究中心将3种二硝基芘异构体列入可能的人类致癌物名单中[6]。3种二硝基芘异构体虽然具有相似的化学结构，但其对生态环境的影响并不相同，1，6-DNP和1，8-DNP的急性毒性约为1，3-DNP的3～4倍[7]。 然而，目前针对3种DNPs同分异构体的分析仍鲜有报道。
环境中nitro-PAHs分析方法主要包含两个步骤： 样品前处理过程和分析检测过程[8]。Nitro-PAHs的含量极低，且成分复杂，需要高效的萃取方法。管内固相微萃取（IT-SPME）是Eisert等[9]提出的一种样品前处理技术，具有操作方法简便、高效、试剂消耗少、易与其它仪器联用的特点，广泛应用于生物分析[10，11] 、食品安全[12]和环境监测[13]等领域。IT-SPME技术已被成功应用于PAHs的萃取分析中[14]，但其在含量低但毒性更大的nitro-PAHs分析中的应用仍鲜有报道。石墨烯是一种由碳原子构成的单层片状结构的二维材料，具有比表面积大、疏水性强、化学稳定性好的优点[15]，已被广泛应用于多环芳烃[16]和酰胺类除草剂[17]等的萃取分析中。氧化石墨烯（GO）表面含有亲水性的含氧官能团，被还原后生成还原氧化石墨烯（rGO）， rGO的亲水性变差，疏水性增强[18]，因而适于疏水性nitro-PAHs的萃取富集，但是，rGO易在固相微萃取整体柱的制备过程产生沉积，不利于其在整体柱中的均匀分布，影响萃取效果。因此，需要建立一种rGO可均匀分布的整体柱制备方法。
Nitro-PAHs样品经过前处理过程后，通常采用气相色谱法[19]或高效液相色谱法[20]对检测物进行分离，然后通过荧光[21]、化学发光[22]、质谱[23]或电化学检测方法[24]等对其进行定性或定量分析。在高温条件下，nitro-PAHs不稳定，易分解，因此高效液相色谱法是分离nitro-PAHs最常用的方法。电化学检测法灵敏度高，但流动相易在电极表面发生电化学反应，产生背景电流[22]。质谱检测法可用于未知结构硝基多环芳烃的检测，但昂贵且体积大的仪器不能满足现场分析的需求。荧光检测法和化学发光检测法选择性好，灵敏度高，且具有较低的检测限，但化学发光法的应用范围受到一定的限制。Nitro-PAHs分子中由于硝基官能团的强吸电子特性，使其在荧光检测器中响应微弱，但当nitro-PAHs上的硝基还原为氨基之后，其荧光响应信号大幅增强。Hasei等[25]使用一个硅胶柱和两个反相C18色谱柱对土壤和大气颗粒物中收集的3，6-二硝基苯并[e]芘样品进行萃取，并通过在线还原-高效液相色谱-荧光检测法进行定量分析。该方法前处理过程复杂，耗时较长，且未用于多组分硝基多环芳烃的同时分析。Watanabe等[26]采用高效液相色谱-荧光检测方法分离检测了3种DNP同分异构体，但该方法使用商业化的不锈钢色谱柱，分析时间较长，且未实现3种样品的完全分离。目前，仍缺乏一种高效、灵敏、快速且操作方便的方法用于多组分硝基多环芳烃的分析。
本研究建立了一种集样品预处理与分离检测于一体的多种nitro-PAHs同分异构体的分析方法。采用催化氢化方法还原3种DNPs同分异构体，并利用构建的IT-SPME-CLC-LIF系统分析了DNPs的还原产物二氨基芘（DAPs）。使用毛细管旋转装置制备了rGO均匀分布的管内固相微萃取柱，提高了萃取效率; 以实验室自制的毛细管填充柱为分离柱，建立了CLC-LIF系统，实现了3种DAPs的快速分离检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
CBIO-UV8D紫外光反应箱（北京赛百奥科技有限公司）; 熔融石英毛细管（25 μm i.d.和100 μm i.d.，美国Polymicro Technologies公司）; KQ2200B超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）; 旋涡振荡器（IKA集团）; HITACHI S-4300扫描电子显微镜（日本日立公司）。
甲基丙烯酸正丁酯（n-BMA， 99%）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA， 99%）、3-（三甲氧基甲硅基）甲基丙烯酸丙酯（γ-MAPS， 98%）、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA， 99%）（百灵威科技有限公司）; N，N-二甲基甲酰胺（DMF， 99%）、丙酮、HCl、NaOH、H3PO4、二氯甲烷（分析纯，北京化工厂）; 荧光素钠（分析纯，北京伊诺凯科技有限公司）; rGO（美国Graphene 3D Lab）; 聚乙二醇-6000、乙腈、乙酸（分析纯，天津市福晨化学试劑厂）; 甲醇（99.9%，天津市四友精细化学品有限公司）; 甲酸铵（98%，国药集团化学试剂有限公司）; 氧化铝载铂（5%，Alfa Aesar公司）; 1，3-DNP、1，6-DNP、1，8-DNP（美国Accustandard公司）; 1，3-DAP、1，6-DAP、1，8-DAP（98%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）。实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm，美国Thermo Scientific公司纯水机制备）。
1.0 g/L DNP储备液制备：取5.0 mg DNP样品，加入5.0 mL二氯甲烷，超声振荡均匀，于4℃条件下储存; 500.0 mg/L DAP储备液制备：取5.0 mg DAP样品，加入10.0 mL甲醇，超声振荡均匀，于4℃条件下储存。
2.2 搭建毛细管旋转装置
毛细管旋转装置包括旋转电机（含毛细管固定装置）、固定旋转电机底座、
旋转电机控制装置和控制毛细管旋转范围的挡板共4部分，其装置结构如图1所示[27]。具体操作过程如下：毛细管沿旋转电机主轴方向放置，两端分别由旋转电机和挡板固定，调节控制装置的转速可以实现毛细管旋转。改变电机连接的固定装置，可实现多根毛细管同步旋转（见电子版文后支持信息图S1所示）。通过改变挡板与固定装置之间的距离实现不同长度毛细管的旋转。
2.3 制备IT-SPME整体柱
在熔融石英毛细管内（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）通过深紫外光引发聚合方法制备聚甲基丙烯酸正丁酯-二甲基丙烯酸乙二醇酯-还原氧化石墨烯（BMA-EDMA-rGO）整体柱。制备整体柱前，首先使用γ-MAPS对毛细管内壁进行乙烯化处理[28]。取BMA（300.0 mg）、EDMA（200.0 mg）、DMF（400.0 mg）、PEG-6000（100.0 mg）、rGO（1.0 mg）和DMPA（5.0 mg）配制预聚合溶液。预聚合溶液经涡旋振荡、超声处理后，注入到乙烯化的毛细管中，使用硅橡胶密封毛细管两端，将该毛细管固定在毛细管旋转装置中，置于紫外反应箱（CBIO-UV8D，254 nm，18 W）中聚合反应约 25 min; 最后用甲醇冲洗毛细管，以去除未反应的单体和致孔剂。
2.4 制备色谱分离填充柱
自制的毛细管填充柱以反相C18固定相为填料，以带有筛板的二通为柱塞，在石英毛细管（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）中通过匀浆填充法制备毛细管色谱分离柱。将C18固定相颗粒分散于丙酮中， 形成匀浆液（20 mg/mL）， 并转移到毛细管柱制柱机中，通过色谱泵将C18颗粒填充入毛细管中，当填充柱长度达到20 cm时关闭色谱泵，然后取下填充好的毛细管并连接另一端的柱塞，最后用高压色谱泵对毛细管填充柱进行压实。
2.5 DNP的还原
参照并改进了文献[24]中催化氢化的方法对DNP样品进行还原（实验装置如电子版文后支持信息图 S2A所示）。 将1.0 mg Pt/Al2O3催化剂和50.0 μL DNP样品（1.0 μg/mL; 溶剂为含5.0 mg/mL甲酸铵的80%甲醇溶液）置于离心管中，超声混合均匀，然后将离心管置于一个不锈钢瓶中，于100 psi（约0.69 MPa）压力下用氮气流加压2 min，置于95℃水浴中反应2 h。最后，将离心管中的溶液离心，收集上清液，检测还原后上清液以及相同浓度DAP样品的荧光强度，按式（1）计算还原效率（Re）：
Re（%）=（A1/A2）×100%（1）
其中， A1是还原后上清液的峰面积; A2是相同浓度DAP样品的峰面积。
2.6 DAP的萃取
萃取过程包括预处理、萃取、洗涤和解析4个步骤。萃取实验装置示意图如电子版文后支持信息图S2B所示。过程如下： （1）预处理 采用甲醇冲洗聚（BMA-EDMA-rGO）整体柱进行预处理; （2）萃取在400 psi （约2.76 MPa）氮气流压力下将20.0 μL 5.0 μg/mL DAP样品加载到萃取柱上，并收集流出液; （3）洗涤 在400 psi氮气流压力下，用10.0 μL超纯水冲洗萃取柱，以洗除杂质，并收集流出液; （4）解析 在400 psi氮气流压力下，将20.0 μL解析溶液注入萃取柱，以洗脱样品，并收集流出液; 最后，在相同条件下，检测5.0 μg/mL DAP标准样品和萃取实验所有收集溶液的荧光信号，按式（2）计算萃取效率（Ee）：
Ee（%）=（A3/A4）×100%（2）
其中，A3是解析后收集溶液的峰面积; A4是DAP标准样品的峰面积。
2.7 DAP的色谱分离
采用搭建的CLC-LIF系统（见电子版文后支持信息S3）进行色谱分离。通过等度洗脱模式进行色谱分离，以乙腈-水为流动相，其中乙腈的浓度范围是50%～70%（V/V）; 采用H3PO4调整流动相至pH 3.7～5.1， 流动相流速300～500 nL/min。采用荧光检测，激发波长375 nm，发射波长405 nm。
3 结果与讨论
3.1 IT-SPME整体柱的表征
预聚合溶液的组成影响聚（BMA-EDMA-rGO）整体柱的形貌、 结构及渗透性，其组成的优化方案见电子版文后支持信息表S1。通过扫描电镜对所制备的整体柱进行了表征（电子版文后支持信息图S4）。表S1中，1号预聚合溶液所制备的整体柱不能形成均一致密的结构，并且整体柱柱体不能良好地结合到管壁上。与2号预聚合溶液相比，3号预聚合溶液所制备的整体柱结构更加致密均匀，具有较大的比表面积，可以提高萃取效率，连续的大孔结构可确保较高的渗透性。因此，最终选择的预聚合溶液组成是：BMA（300.0 mg）、EDMA（200.0 mg）、DMF（400.0 mg）、PEG-6000（100.0 mg）、rGO （1.0 mg）和DMPA（5.0 mg）。
為了实现rGO在聚合物基体中的均匀分散，采用实验室自制的毛细管旋转装置制备整体柱。图2A是在水平静置条件下所制备整体柱的显微镜图片，可见明显分层结构，黑色的rGO多沉积于毛细管底部。由图2B可见，通过毛细管旋转装置所制备整体柱中rGO片层可均匀地分布在聚合物基体中。通过比较静置与旋转状态下所制备的整体柱的形貌 （图2C和2D），其整体形貌无明显差别，毛细管旋转装置对整体柱聚合过程无明显影响，但是从图2C明显看出同一个截面左右出现分界区域，左边颜色偏深，右边颜色偏浅，这与图2A中观察到的分层现象一致，进一步说明水平静置条件下所制备整体柱中rGO分布不均匀。
萃取整體柱的SEM表征结果如图3所示。在优化的预聚合溶液组成条件下可以制备结构均匀的整体柱（图3A），聚合物基体与毛细管内壁结合紧密（图3B）。所制备的整体柱具有三维网状骨架结构，由通孔和微孔构成。通孔的尺寸约5 μm（图3C），因此具有良好的通透性，在样品萃取过程中，有利于快速均匀地传质。由图3D可见到嵌入到整体柱中的rGO片层。
3.2 DNP的还原效率
DNP还原效率的测定在中空的毛细管（100 μm i.d.; 360 μm o.d.）中进行，以50%（V/V）乙腈为流动相，以LIF为检测器，在0.14 MPa（20 psi）氮气流压力下驱动还原产物进行检测。根据公式（1）计算其还原效率。3种DNP的还原效率为99.53%～110.13%（表1），说明本方法还原效率较高。
3.3 优化解析溶剂和计算DAP的萃取效率
采用与3.2节中相似的装置检测萃取前后的样品。 萃取后流出溶液中未检出样品信号峰，说明聚（BMA-EDMA-rGO）整体柱对DAP具有较强的萃取能力。为了获得较好的解析效率，对解析溶剂进行了优化（见电子版文后支持信息图S5）。解析溶剂的详细优化方案见电子版文后支持信息表S2。实验结果表明，80%甲醇（V/V， pH=4.5）作为解析试剂时，解析效率较高。3种DAP的萃取效率在82.48%～91.65%之间（表2）。上述结果表明，聚（BMA-EDMA-rGO）整体柱对DAP具有较好的萃取性能。
3.4 色谱分离条件的优化
考察了3种流动相浓度对DAP样品分离的影响（图4A）。当乙腈浓度由50%（V/V）提高到70%（V/V）时，由于高比例乙腈对于DAP样品的强洗脱能力，其在色谱柱中的保留减弱，并且随着乙腈浓度的提高，3种DAP样品分离度降低，因此，应选择低浓度乙腈作为流动相。然而，由于DAP样品与C18链有较强的疏水作用，随着乙腈浓度降低，流动相洗脱能力减弱，色谱峰拖尾现象越来越严重。因此，本研究没有进行更低浓度乙腈作为流动相的探索，选择50%（V/V）乙腈作为色谱分离流动相条件继续进行优化实验。
流动相流速对样品分离的保留时间和分离度具有重要影响，本研究选择了3种流动相流速（300、 400和500 nL/min） 对于DAP样品进行分离（图4B）。当流动相流速由500 nL/min降低到300 nL/min时，DAP样品与C18链之间的相互作用时间延长，增加了样品的保留，色谱峰的拖尾现象严重，并且在低流速下其分离时间过长。然而，当流速大于500 nL/min时，分离压力接近色谱泵的最大压力。因此，最终采用500 nL/min的流速进行实验样品的色谱分离。
使用H3PO4调节流动相的pH值，考察流动相pH值对色谱分离的影响。1，3-DAP、1，6-DAP和1，8-DAP的pKa分别为5.07、4.82和4.84，因此调整流动相的pH范围为3.7～5.1，图4C为使用不同pH值流动相的分离结果。以1，3-DAP和1，6-DAP为例计算分离度（电子版文后支持信息表S3），结果表明，在pH=4.3的流动相条件下，3种样品的峰形最好，两种样品的分离度最高（R36=2.71），而在其它pH条件下，由于3种DAP样品质子化程度不同，影响了样品与固定相之间的静电作用，造成了色谱峰的展宽。综上，得到最优的色谱分离条件为：流动相为50%（V/V）乙腈， pH=4.3，流速为500 nL/min。
3.5 IT-SPME-HPLC系统的最优分离结果
经过系统的优化分析，得到的优化分离结果如图5所示，在10 min内实现3种DAP同分异构体的完全分离，其中1，3-DAP、1，6-DAP和1，8-DAP的理论塔板数依次为12272、9121和10979 plates/m。3种DAP样品的分离度分别是R36=3.95、R68=2.16和R38=1.80。1，3-DAP和1，6-DAP之间的分离度RSD=2%（n=3）。本系统可实现DAP同分异构体的快速分离与分析。
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Catalytic Reduction-In-Tube Solid Phase Microextraction-Capillary
Liquid Chromatography System for Analysis of Dinitropyrene Isomers
LI Ke， WANG Yu， YAN Yong， ZHAO Lei， ZHANG Dong-Tang， WANG Ya-Nan， GUO Guang-Sheng， WANG Xia-Yan*
（Center of Excellence for Environmental Safety and Biological Effects， Beijing Key Laboratory for Green Catalysis and
Separation， Department of Chemistry and Chemistry Engineering，
Beijing University of Technology， Beijing 100124， China）
Abstract In this study， a catalytic reduction-in-tube solid phase microextraction coupled with capillary liquid chromatography （CR-IT-SPME-CLC） system was developed for rapid analysis of dinitropyrene isomers （DNPs）. Pt/Al2O3 and ammonium formate were used as catalyst and hydrogen donor respectively， and three DNPs were reduced efficiently by catalytic hydrogenation at 95℃. A solid phase microextraction monolithic column embedded into nanomaterial with uniform distribution of reduced graphene oxide and good permeability， which was prepared using self-made capillary rotating device by optimizing the composition of the pre-polymerization solution. For highly efficient extraction of three dinitropyrene reduction products， desorption solution of solid phase microextraction was optimized， and the extraction efficiency was 80.47%-93.37%. Capillary chromatography column was packed with C18 particles （5 μm） at high chromatographic pump pressure， and a capillary liquid chromatography-laser induced fluorescence detection system was established. Complete separation of three diaminopyrenes was achieved in 10 min by optimizing the chromatographic separation conditions. The proposed method is simple， rapid and sensitive for the analysis of DNP isomers among nitropolycyclic aromatic hydrocarbons.
Keywords Capillary rotating device; Dinitropyrene isomers; Catalytic reduction; In-tube solid phase microextraction; Capillary liquid chromatography-laser induced fluorescence detection.
