支气管肺发育不良早产儿血中RELM-β、VEGF表达及意义

邵 婕 徐 艳 王 军

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿、尤其是小早产儿肺部常见疾病,近年来，伴随医疗水平的改善，小早产儿成活率大大提高，随之带来BPD患儿人数增多；BPD病死率较高，存活者在早期离氧难、喂养难，婴儿期肺功能较差，再入院率明显高于正常婴儿，给患儿家庭及社会带来很大的精神、经济压力。目前尚无有效的治疗BPD的办法，因此早期识别及预防BPD显得尤为重要。RELM-β是一种在肺组织、血液、胃肠等组织表达的蛋白，在哮喘、COPD等多种呼吸道疾病中起到参与血管重建、调节肺纤维化进程、发挥炎性效应等作用，而BPD恰恰是炎性反应修复的结果[1]；VEGF被认为是一种促进血管新生的重要因子，对肺上皮细胞的生长发育有重要作用。本研究通过监测早产儿生后血清RELM-β、VEGF水平变化，探讨血清RELM-β、VEGF蛋白表达在早产儿BPD早期发病过程中的作用。

对象与方法

1.对象与分组：选取2017年1月～2018年7月在徐州医科大学附属医院儿科医院NICU住院早产儿52例。纳入标准：胎龄在28～32周且出生体重<1500g，入院后即应用呼吸机支持且住院时间超过28天的早产儿。排除标准：先天发育畸形、严重先天性心脏病、先天性肿瘤、遗传代谢性疾病。根据有无BPD分为BPD组(n=24)和非BPD组(n=28) 。BPD诊断标准参照美国国立儿童健康与人类发展研究院在BPD研讨会中提出的标准：任何氧依赖(>21%)≥28d的新生儿即可诊断为BPD。本研究已通过徐州医科大学附属医院伦理学委员会批准，征得患儿家长同意，并签署知情同意书。

2.实验方法

(1)标本收集及主要实验器材：收集患儿胎龄、出生体重、Apgar评分、性别、分娩方式等一般资料，于出生后3天内、7天、14天分别采集外周血1ml，肝素抗凝管保存，采集标本后 30min内离心 15min(4℃，2000r/min，离心半径为10cm)，分离血清，分别于-80℃冰箱保存。电泳仪(DYCZ-40) 购自美国Bio-Rad公司,凝胶成像系统购自天津市汉中摄影材料厂。酶标仪(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)购自美国Thermo公司。抗人RELM-β、VEGF购自美国Bio-Rad公司。人RELM-β、VEGF ELISA 试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

(2)ELISA法检测血清RELM-β、VEGF水平：从-80℃超低冰箱中取出保存的血浆，室温解冻后离心(3000r/min，离心半径10cm，离心15min)，待检测。将各种试剂移至室温(18～25℃)平衡30min，并配制试剂备用。取出酶标板，分别设标准品孔、待测样品孔，每孔分别加标准品或待测样品100μl，轻轻晃动混匀，贴上板贴，37℃温育2h，弃去液体，甩干。每孔加生物素标记抗体工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1h，弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μl，覆上新的板贴，37℃温育1h，弃去孔内液体，甩干，洗板5次。依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色15～30min。依序每孔加终止溶液50μl，终止反应。在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔吸光度(A值)，然后计算样本浓度。

(3)Western blot法检测血清RELM-β、VEGF水平：从-80℃超低温冰箱中取出保存的上清液，采用 BCA 法测定蛋白浓度水平，等量等体积(20μl)蛋白样本上样。采用 80V/120V电压电泳，使检测蛋白到达最佳分辨区；转膜将蛋白转到 PVDF膜上，用 Western 封闭液封闭 2h，分别孵育 RELM-β一抗(1∶1000)、β-actin 一抗(1∶1000)，4℃过夜；之后将 PVDF 膜在二抗 (1∶50000)中摇床孵育 2h；ECL增强液显色；用扫描仪获取图像，运用Image-J图像分析软件分析各目的条带的灰度值。以RELM-β、β-actin 的灰度值比值确定RELM-β表达的相对水平。

结 果

1.一般资料分析:BPD组共24例，其中男性14例，女性10例，出生胎龄30.44±1.57周，出生体重1390±330g；非BPD组共28例，其中男性13例，女性15例，出生胎龄30.82±1.70周，出生体重1370±220g。两组早产儿出生胎龄、体重、性别等，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1 两组早产儿临床资料比较

2.ELISA法检测两组血清RELM-β、VEGF水平：两组的血清RELM-β水平生后3天内较低，随后逐渐上升，14天达到高峰，组内各时间点两两比较，差异有统计学意义；BPD组RELM-β水平在各个时间点之间都高于非BPD组，3天内两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，7天、14天两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。两组的血清VEGF水平生后3天内最低，后逐渐上升，14天最高，组内不同时间点之间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)；各个时间点BPD组的VEGF水平均低于非BPD组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表2 各组早产儿不同时间点血清RELM-β水平比较

3.Western blot法检测两组血清RELM-β水平：两组的血清RELM-β水平生后3天内较低，随后逐渐上升，14天达到高峰，组内各时间点两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)；BPD组RELM-β水平在各个时间点之间都高于非BPD组，3天内两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，7天、14天两组VEGF水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，详见表4、图1。两组的血清VEGF水平生后3天内最低，后逐渐上升，14天最高，组内不同时间点之间两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。各个时间点BPD组的VEGF水平均低于非BPD组，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表5、图2。

表3 各组早产儿不同时间点血清VEGF水平比较

表4 各组早产儿不同时间点血清RELM-β蛋白表达水平比较

表5 各组早产儿不同时间点血清VEGF蛋白表达水平比较

图1 Western blot法检测两组血清RELM-β表达水平

图2 Western blot法检测两组血清VEGF表达水平

讨 论

支气管肺发育不良发病原因多种，极低出生体重、机械通气等为BPD的高危发病因素[2]。现多认为BPD的发病是以遗传易感性为基础，宫内、出生后多种不利因素的共同作用下引起肺损伤及损伤后异常修复， IL-8、TGF-β、MMP-9等多种细胞因子参与其中[3,4]。BPD尚无有效治疗手段，且预后不佳。BPD患儿在新生儿期用氧时间长，易合并早产儿视网膜病变、呼吸机相关肺炎等疾病，严重可致死亡；在婴儿期至青春期，合并哮喘等呼吸道疾病的概率较大，神经系统障碍发生率也显著高于非BPD早产儿[5，6]。

抵抗素样分子β(RELM-β)是抵抗素样分子家族中的一员，目前被发现的家族成员还有RELM-α、resistin 、RELM-δ。RELM-β与RELM-α有密切同源性。在小鼠肺组织中，RELM-α通过ERK/MAPK-PI3K/Akt信号通路参与肺损伤后的肺血管重塑、肺动脉高压等过程，也参与小鼠支气管肺发育不良的发病[7，8]。RELM-β最早在结肠发现，后来被证实在肺、心脏等组织中也有表达，RELM-β可作为促有丝分裂因子，诱导小鼠的肺纤维化，刺激气道上皮细胞增殖，促进黏蛋白、生长因子等多种转化介质的产生，参与肺血管重塑[9]。有研究者在探究RELM-β在气道重塑中作用的体外实验中发现，当RELM-β的表达增多时， RELM-β可诱导气道上皮细胞增殖，通过ERK/MAPK-PI3K/Akt信号通路，促进血管内皮生长因子(VEGF)分泌,这也说明RELM-β与RELM-α在不同物种内可能通过相似的通路发挥作用[10]。

VEGF在富血管组织中皆有分布，如肿瘤组织、肺组织等，在肺组织中，由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌，对肺血管的形成、修复起到举足轻重的作用，可通过PLC-IP3-前列腺素通路改善血管通透性，经PI3K/Akt-NOS-NO通路刺激血管新生，通过PI3K-PIP3-Akt/PKB通路信号通路减轻肺泡损伤，在慢性阻塞性肺疾病、非小细胞肺癌中与疾病严重程度相关[11]。有研究表明BPD小鼠肺组织内呈低水平的VEGF分布,提示低VEGF与BPD发病相关，应用重组VEGF治疗后的受损肺组织的肺泡数量及肺微血管密度得到一定程度的改善[12]。

综上笔者推测，参与多种肺部、血管相关性疾病病理生理过程的RELM-β、VEGF在BPD发生过程中可能也发挥一定的作用。本研究中患儿胎龄、体重小，肺发育不成熟，绝大部分有氧气应用史，而在临床治疗过程中，呼吸支持常伴随着氧供给、机械通气损伤、氧自由基生成，损伤肺组织；另外宫内、宫外感染等可引起炎性因子的大量释放，造成气道损伤，在各方面综合因素影响下，导致了BPD的形成。本研究结果显示，BPD组患儿各个时间点RELM-β表达均高于非BPD组，3天内两组RELM-β水平比较差异无统计学意义，7天、14天两组RELM-β水平比较差异有统计学意义(P<0.05)；两组VEGF表达水平生后3天内最低，后逐渐上升，14天最高，各个时间点BPD组的VEGF水平均低于非BPD组，差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，BPD早产儿RELM-β表达水平较高，而BPD早产儿VEGF表达水平则低于非BPD早产儿。

有国外研究提示BPD早产儿出生后体内VEGF水平低于非BPD早产儿[13]。这与本研究结果相符合， VEGF水平表达减低和BPD的发病相关，联合应用VEGF、Ang-Ⅱ等干预后的BPD小鼠肺组织呈现出新生血管网增多、肺部炎症及水肿明显减轻等现象，提示VEGF参与肺损伤后的修复，BPD患儿体内VEGF水平低恰恰可能导致肺损伤后修复不足[14]。前文提到RELM-β分泌增多后可刺激VEGF的正向生成，笔者推测，在BPD的病理生理改变开始后，机体可能通过代偿性上调RELM-β的分泌，刺激 VEGF正向生成，从而促进微血管新生，调节毛细血管通透性，改善肺泡氧合，对高氧、机械通气等造成的肺损伤进行修复，改善停滞的肺发育；当病情进展，肺损伤越来越重时，机体或选择进一步增加RELM-β的分泌来代偿加重的肺损伤。

综上所述，笔者推测RELM-β、VEGF可能作为保护性细胞因子，参与BPD患儿早期发病后的组织损伤修复，这为预测、干预BPD早期发病与进展提供更多思路。但是本研究样本量较小，追踪时间较短，尚未监测到RELM-β水平的高峰时间点，在接下来的进一步研究中，需进一步扩大样本量，延长监测时间，深入探究RELM-β在BPD发展过程中的意义。