水飞蓟宾对心肌缺血再灌注性心律失常的影响及机制探索

曹旭丹 任春梅 和田田 李素华 李 莉

及时恢复血流是临床上治疗急性心肌梗死的首选方案，但缺血再灌注损伤严重影响该患者预后，而心律失常则是其主要表现形式，超过50%的死亡病例的致死原因是心肌缺血再灌注所致心律失常，因此防治心律失常或许是提高急性心肌梗死临床疗效的可靠途径[1,2]。水飞蓟宾(Silibinin，SIL)是一种具有抗氧化、促进细胞再生等多种生物活性的水飞蓟素[3,4]。既往研究发现，SIL能够通过抑制氧化应激、抑制细胞凋亡、改善心功能等而对心肌缺血再灌注损伤起到一定的保护作用[5～7]。但SIL是否对心肌缺血再灌注所致心律失常具有影响尚未见文献报道。本研究通过制备大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并提前给予SIL进行预处理，研究SIL对心肌缺血再灌注性心律失常的影响并探索其机制。

材料与方法

1.实验动物:实验用SD大鼠(雄性，SPF级，体质量250～300g，鼠龄8周龄)购自河北省实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。饲养环境：室温23～25℃、相对湿度65%～70%，光照周期12h∶12h，手术前24h禁食、自由饮水。

2.试验药物与试剂:水飞蓟宾胶囊(天津天士力制药股份有限公司，药品规格：35mg/粒，批号：20171103)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20170624、20170813、20171008)；一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：20161229、20170316)；Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20161130、20160924)；钙标准液(上海生物制品研究所)。

3.实验方法：(1)动物分组、造模与给药:取120只实验用SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组和SIL低[100mg/(kg·d)]、中[200mg/(kg·d)]、高[400mg/(kg·d)]剂量组和维拉帕米组[2.5mg/(kg·d)]，各20只。术前7天开始灌胃给药(1次/天)，正常对照组和模型组同步灌胃给予0.9%氯化钠溶液。参照柴丽娜等[8]报道的通过结扎冠状动脉前降支复制大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型；假手术组除不结扎外，其余操作同模型组。参照Zhang等[9]报道的方法对造模结果进行判断，心电图ST段抬高、心肌局部变苍白表示结扎并缺血成功；松开动脉夹后苍白区心肌恢复红润、ST段抬高程度恢复1/2以上则表示再灌注成功。(2)Ⅱ导联心电指标监测:记录心电图PR间期、QRS间期以及ST段变化，计算各组大鼠室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)发生率；然后参照李涛等[10]报道的方法进行心律失常评分：<5次室性前期收缩，计0分；仅≥5次室性前期收缩，计1分；仅<60s室性心动过速，计2分；一阵≥60s或多阵累计<60s室性心动过速，计3分；多阵VT累计>60s，计4分；出现VF计5分。(3)心肌组织生化指标检测：麻醉后取心脏组织，剪碎，研磨匀浆，经3000r/min低温(4℃)离心15min后取上清液，遵照试剂盒步骤处理后通过紫外-可见分光光度计测定Na+-K+ATPase、 Ca2+-Mg2+ATPase、SOD、GSH-Px活性和MDA含量；通过原子吸收光度计测定心肌细胞内Ca2+浓度；采用催化L-Arg比色法测定NOS活性，硝酸酶还原法检测NO含量。

4.统计学方法：运用SPSS 13.0统计学软件对数据进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.心电图监测结果:模型组大鼠心电图PR、QRS间期较假手术组均显著缩短，ST段明显升高(P<0.01)；而与模型组比较，经SIL中、高剂量组或维拉帕米组预处理能够显著延长心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心电图PR间期和QRS间期，降低ST段抬高程度，差异有统计学意义(P<0.05)。随着SIL给药剂量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心电图PR间期和QRS间期呈延长趋势，ST段抬高程度呈降低趋势。SIL高剂量组与维拉帕米组比较，PR、QRS间期和ST段比较差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 各组大鼠心电图监测结果

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，ΔP<0.01

2.心律失常发生率及评分:模型组室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)发生率较假手术组显著升高(P<0.01)，心律失常评分显著升高(P<0.01)；而与模型组比较，经SIL中、高剂量组或维拉帕米组预处理能够显著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠VT、VF发生率并降低心律失常评分(P<0.05)。与SIL低剂量组比较，SIL高剂量组大鼠VT、VF发生率显著降低且心律失常评分显著降低(P<0.05)。与维拉帕米组比较，SIL高剂量组VT、VF发生率差异均无统计学意义(P>0.05)，心律失常评分显著降低(P<0.05，表2)。

表2 各组大鼠VT、VF发生率和心律失常评分

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，ΔP<0.01；与维拉帕米组比较，▲P<0.05

3.ATPase活性和Ca2+浓度:模型组大鼠心肌组织Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性较假手术组降低且心肌细胞Ca2+浓度升高(P<0.01)；而与模型组比较，经SIL中、高剂量组或维拉帕米组预处理能够显著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性并降低Ca2+浓度(P<0.05)。随着SIL给药剂量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠Na+-K+ATPase、Ca2+-Mg2+ATPase活性呈升高趋势，Ca2+浓度显著降低(P<0.05)。与维拉帕米组比较，SIL高剂量组Na+-K+ATPase活性差异无统计学意义(P>0.05)，Ca2+-Mg2+ATPase活性显著升高且Ca2+浓度显著降低(P<0.05,表3)。

表3 各组大鼠心肌组织ATPase活性及Ca2+浓度

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，ΔP<0.01；与维拉帕米组比较，▲P<0.05

4.NOS活性和NO含量:模型组大鼠心肌组织NOS活性和NO含量较假手术组明显降低(P<0.01)；而与模型组比较，经SIL中、高剂量组预处理能够显著提高心肌缺血再灌注性心律失常大鼠NOS活性和NO含量(P<0.05)。随着SIL给药剂量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌组织NOS活性和NO含量均呈升高趋势。与维拉帕米组比较，SIL高剂量组NOS活性和NO含量均显著升高(P<0.05，表4)。

表4 各组大鼠心肌组织NOS活性和NO含量

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，ΔP<0.01；与维拉帕米组比较，▲P<0.05

5.抗氧化酶活性和MDA含量:模型组心肌组织抗氧化酶SOD、GSH-Px活性较假手术组明显降低且MDA含量明显升高(P<0.01)；而与模型组比较，经SIL中、高剂量组预处理能够显著降低心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活性并显著降低MDA含量(P<0.05)，经维拉帕米组预处理能够显著提高SOD活性并降低MDA含量(P<0.05)。随着SIL给药剂量的升高，心肌缺血再灌注性心律失常大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活性呈升高趋势，MDA含量呈降低趋势。与维拉帕米组比较，SIL高剂量组GSH-Px活性显著升高且和MDA含量均显著降低(P<0.05)，SOD活性差异无统计学意义(P>0.05,表5)。

讨 论

心律失常是心肌缺血再灌注损伤的主要表现形式之一，以室性心动过速(VT)、心室颤动(VF)等较为多见，此外还有心房颤动、房室传导阻滞等，并且心律失常是急性心肌梗死再灌注后死亡的主要原因之一[11～13]。维拉帕米是一种钙离子拮抗剂，是临床上治疗心律失常的一线用药[9]。本实验选择维拉帕米作为阳性对照药物。

表5 各组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量

与假手术组比较，*P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，ΔP<0.01；与维拉帕米组比较，▲P<0.05

水飞蓟宾(Silibinin，SIL)是一种表现出多种生物学活性的水飞蓟素，本研究通过制备大鼠心肌缺血再灌注性心律失常模型并于造模前7天给予SIL进行预处理，研究发现经SIL预处理能够改善缺血再灌注性心律失常大鼠心律失常状况，表现为延长心电图PR、QRS间期并降低ST段抬高程度，降低VT、VF发生率，降低心律失常评分，说明SIL具有抑制或缓解心肌缺血再灌注所致心律失常风险的作用，并且该作用呈一定的剂量相关性。

能量代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要病理机制，ATP合成受阻将导致依赖ATP的Ca2+-Mg2+ATPase活力降低，使细胞内Ca2+泵出能力下降，导致心肌细胞Ca2+超载进而引发心律失常[10,14，15]。氧化应激损伤和能量耗竭将导致Na+-K+ATPase活力进一步降低，进而使细胞外K+增多，导致缺血中央至边缘区K+含量逐渐下降的不均匀分布态势，这也是导致心律失常的重要原因之一[16]。本研究结果显示，经SIL预处理能够明显改善缺血再灌注性心律失常大鼠心肌组织Ca2+-Mg2+ATPase、Na+-K+ATPase活力并降低心肌细胞Ca2+含量，改善SOD、GSH-Px活性并降低氧化应激损伤，SIL上述作用呈现一定的剂量相关性，这可能是SIL能够抑制心肌缺血再灌注后发生心律失常的重要分子机制。

NO具有调节冠状动脉血流量、改善缺血心肌细胞灌流而减轻室性心律失常的生理学作用，并且能够通过降低心肌收缩力、减少心肌耗氧量，从而提高心肌细胞氧供/需比[17]。NOS是机体内促进NO生产的酶。本研究发现，经SIL预处理能够改善NOS活性并提高NO含量，并且随着SIL剂量升高，上述作用增强，这可能也是SIL抑制心肌缺血再灌注性心律失常的机制之一。

综上所述，SIL对大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常具有一定的剂量相关性保护作用，可能与SIL能够改善ATPase活性、降低心肌细胞Ca2+浓度、提高NO含量、抑制氧化应激等有关。