PPAR-β对小鼠脓毒症肝损伤的研究

张馨予 李娜娜 赵鸣雁 康 凯

脓毒症(sepsis)是由感染导致的一类机体炎性反应，反映了感染后的全身炎性综合征[1]。脓毒症是导致重症监护病房患者死亡的主要原因之一，全球每年约有1800万病例，随着重症监护病房救治技术的进步，患者病死率虽然已显著下降，但仍高达20%～48%[2]。导致患者死亡的原因是多器官衰竭。肝脏可以清除细菌并对炎性介质产生防御反应，是脓毒症最易损伤的器官之一。早期研究认为，在脓毒症导致的肝功能障碍中，黄疸和高胆红素血症为疾病的晚期表现，目前研究认为，肝功能的损伤常发生在早期[3]。脓毒症肝损伤根据发病机制分为原发性和继发性两类，原发性肝损伤主要是由于缺血及再灌注致肝细胞缺血缺氧性损伤为主，继发性肝损伤主要由于炎性因子及感染内毒素导致的炎性损伤为主[4]。目前研究认为，脓毒症相关的肝功能障碍主要是由全身或微循环障碍、细菌和内毒素(脂多糖)移位以及随后炎性细胞因子和介质的激活引起的[5～7]。然而，脓毒症合并肝损伤的发病机制较为复杂，各因素之间可以相互影响相互作用，目前对这一疾病的病理生理机制仍处于研究探索中。

近年来，过氧化物酶增殖物激活受体(peroxisome proliferater-activated receptor，PPAR) 在炎性反应中的作用逐渐被人们重视[8，9]。PPAR包括 PPAR-α、PPAR-β和 PPAR-γ 3种亚型[10]。当前研究表明，PPARs 在细胞能量代谢、增殖凋亡、脂质稳态、炎性反应调节等方面发挥重要作用，目前研究较多的是 PPAR-α和PPAR-γ[11～13]。既往文献表明，PPAR-γ能够减轻脓毒症大鼠肝损伤[14]。同时，有研究者发现应用PPAR-β内源性激动剂能明显增加 PPAR-β表达，可以通过抑制环氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，减少氧自由基的释放，从而减少肝脏的脂质过氧化，减轻肝脏氧化应激损伤[15]。有相关文献报道PPAR-β是NF-κB 上游效应分子，能够通过抑制 NF-κB 的活化，从而减低 LPS介导的TNF-α和 IL-1β介导的PGE2 的表达。由此认为，PPAR-β具有抑制炎性反应及抗凋亡作用[16]。目前，关于 PPAR-β在脓毒症中的相关研究报道极为有限，尚无深入的机制研究。

本实验采用LPS制备最符合临床脓毒症患者病理生理过程的脓毒症动物模型，观察脓毒症对肝的影响，并通过腹腔注射选择性激动剂GW0742 和抑制剂GSK0660进行干预，观察PPAR-β能否在脓毒症小鼠的肝组织发挥保护作用，探讨PPAR-β在脓毒症肝损伤中能否抑制环氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，减少线粒体氧自由基的释放，从而起到抗炎、抗氧化和抗凋亡的保护作用，有望为脓毒症肝损伤的防治提供新的治疗靶点，提供新的靶向治疗药物。

材料与方法

1.材料：(1)实验动物：SPF 级雄性 C57/BL 小鼠 8～10 周龄，由哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供，用于实验的小鼠体质量约为20～30g。(2)主要仪器和试剂：0412-1型台式离心机购自上海手术器械厂，全自动生化分析仪购自德国西门子公司，PPAR-β激动剂GW0742 和抑制剂GSK0660购自美国Sigma 公司，小鼠源单克隆抗体IL-1β、IL-18、TNF-α、capase-1、NF-κB购自英国 Abcam 公司，小鼠 IL-1β、IL-18、TNF-α的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒、β-actin 小鼠源单克隆抗体、羊抗小鼠免疫球蛋白G辣根过氧化物酶(immunoglobulin-horseradish peroxidase，IgGHRP)，二抗均购自武汉伊莱瑞特生物工程有限公司。

2.方法：(1)实验动物分组：120只SPF级雄性小鼠随机分为假手数组(SHAM)、脓毒症肝损伤组(LPS)、肝损伤+激动剂组(LPS+GW0742)、肝损伤+抑制剂组(LPS+GSK0660)，每组均为30只。每组小鼠于造模后再按6、12、24h 3个时间分为3个亚组,每组各10只。(2)脓毒症小鼠肝损伤模型建立：SPF级小鼠在实验前12h开始禁食，实验前4h禁水。实验前称体质量，Sham组于造模前1h腹腔注射200μl生理盐水,LPS组腹腔注射LPS 5mg/kg(等渗氯化钠溶液稀释至1ml)，LPS+GW0742组和LPS+GSK0660组分别于造模前1.5h腹腔注射GW0742和GSK0660，相应的剂量参照以往研究分别设定为0.3mg/kg和1mg/kg[17]。3个时间点之前死亡的小鼠被排除在研究之外。3组小鼠分别于造模后6、12、24h予10%水合氯醛腹腔注射实行麻醉(3.5ml/kg)。麻醉满意后，固定于仰卧位,于腹正中线行1.5～2.0cm的纵行切口,充分暴露腹部，取心脏血及小鼠肝组织。本实验中动物处置方法符合哈尔滨医科大学动物伦理学标准。 (3)血标本采集:充分暴露胸部后，以1ml注射器缓慢抽血，收集血液试管为枸橼酸抗凝试管,静置 15min(至于冰块中),再离心(5000r/min)3min,取上清液,分装做好标记, -80℃冰箱保存,待行血清肝功能检测。(4)组织标本采集:小鼠处死后,打开腹腔,游离肝脏并取出,取出的肝脏分为两部分,1份-80℃冰箱保存,另1份置入4%多聚甲醛溶液中固定12h以上,然后进行石蜡包埋、切片，并行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色,观察病理组织学改变。

3.检测方法：(1)小鼠血清指标检测：取上清液，采用全自动生化分析仪检测小鼠血清中ALT、TBIL 和AST的浓度值。 (2)小鼠肝脏病理切片：小鼠肝脏组织浸泡于甲醛溶液中固定24h后，将肝脏组织切至3mm，经过脱水、透明、浸蜡等过程，放置于石蜡包埋盒中包埋，包埋后切片，厚度约为6μm，烘烤约2h，置于室温过夜。石蜡切片经过软化、脱蜡、组织软化、苏木精染色、盐酸乙醇分化、伊红染色、脱水、透明后封片。HE染色切片应用 BI-2000多功能病理图像分析系统放大不同倍数观察其病理变化。 (3)ELISA 法测定小鼠肝组织 IL-1β、IL-18、TNF-α水平：取 0.1g肝组织，置于冰上剪碎，加入PBS液600μl，再加入PMSF液6μl，低温匀浆，3000r/min离心20min，取上清液并做好标记。依次将不同浓度的标准品加入酶标板中，将10μl标准品和40μl样品稀释液先后加入预先设计的孔中，加入由过氧化物酶(HRP)标记的抗体50μl上述孔中，孵育60min。倒掉上层液体，吸干，反复洗涤(5次)，在所有孔中各加入50μl A、B，37℃避光孵育15min。最后加入终止液50μl，通过连续波长酶标仪测定450nm 处吸光度值，再根据计算公式得出实际样品浓度。(4)Western blot法测定小鼠肝组织蛋白(IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1、NF-κB)水平:取0.003g肝组织，加入1ml RIPA裂解液、10μl PMSF,置于冰上剪碎组织，匀浆后使用振荡器震荡6次(5min 1次，每次20s),12000r/min离心10 min，取上清液并做好标记。取96孔酶标板，配制蛋白标准液，按照浓度梯度依次加入标准蛋白稀释液、200μl BCA试剂、20μl待测蛋白,37℃孵育箱孵育30min，在酶标仪上590nm处测吸光值，绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度，并根据样品体积和稀释度计算原来样品中的蛋白量。取上清液120μl，加入30μl SDS-PAGE,振荡摇匀后煮沸10min。经过制胶、加样、电泳、转膜、封闭，加入小鼠源单克隆抗体IL-1β、IL-18、TNF-α、caspase-1、NF-κB 5μl 和β-actin小鼠源单克隆抗体17μl，置于4℃冰箱中过夜，次日漂洗后加入(兔抗小鼠)IgG-HRP 二抗2μl并放置于4℃冰箱中2h以上准备曝光。曝光前加入配置好的化学发光试剂，利用化学凝胶成像系统测定蛋白及β-actin蛋白灰度值，保存图片及数据。

结 果

1.各组小鼠生存率比较:于造模后6、12、24h观察各组小鼠有无异常反应，4组小鼠均无死亡，Sham组小鼠未见异常反应；LPS组及LPS+GSK0660组中小鼠出现不同程度的精神不振、萎靡、少动、蜷缩、发抖、嗜睡、进食减少或拒食等情况；LPS+GW0742组小鼠6、12h时出现不同程度的精神不振，24h精神较前好转。

2.各组小鼠血清指标比较:为检测PPAR-β对脓毒症肝损伤的保护作用，将4组小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平的进行比较。与Sham组比较，LPS组小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)；与LPS组小鼠比较，LPS+GW0742组小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平均显著降低,差异有统计学意义(P=0.000)。与LPS组小鼠比较，LPS+GSK0660组小鼠血清中ALT、AST和TBIL水平无显著变化，差异无统计学意义(P>0.05)。同时将4组小鼠不同时间段血清指标分别进行比较，Sham组3个时间段比较差异无统计学意义(P>0.05)。LPS组、LPS+GW0742组、LPS+GSK0660组从6h开始，ALT、AST和TBIL水平显著升高，12h达到高峰，24h水平逐渐减低,详见表1，图1～图3。

表1 各组小鼠血清不同时间ALT、AST和TBIL比较

ALT.谷氨酸-丙酮酸转氨酶；AST.天门冬氨酸氨基转移酶；TBIL.总胆红素(bilirubin)；LPS.脓毒症肝损伤；LPS+GW0742.脓毒症肝损伤+激动剂；LPS+GSK0660.脓毒症肝损伤+抑制剂

图1 血清ALT水平变化

图2 血清AST水平变化

图3 血清TBIL水平变化

3.各组小鼠肝组织病理切片比较:如图4所示，与Sham组比较，LPS组肝小叶结构被破坏、细胞间隙模糊、炎性细胞浸润、肝细胞肿胀、水样变性以及肝细胞再生；LPS+GW0742组肝小叶结构基本正常，肝细胞肿胀、坏死减少，炎性细胞浸润减少；LPS+GW0660组肝脏病理变化与LPS组基本相同。

4.各组小鼠炎性指标水平比较

(1)采用ELISA法，检测肝组织匀浆的上清液中炎性指标TNF-α、IL-1β、IL-18水平：以判断PPAR-β对脓毒症肝损伤是否有保护作用。与Sham组比较，LPS组小鼠肝组织匀浆的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与LPS组小鼠比较，LPS+GW0742组小鼠肝组织匀浆的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组小鼠比较，LPS+GSK0660组小鼠肝组织匀浆的上清液中TNF-α、IL-1β、IL-18水平无显著变化,差异无统计学意义(P>0.05)，详见图5～图7。

图4 肝脏病理变化(HE,×40)

图5 TNF-α水平变化

图6 IL-1β水平变化

图7 IL-18水平变化

(2)各组小鼠肝脏蛋白表达情况:采用Western blot 法检测各组小鼠肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-18、caspase-1、NF-κB水平，以判断PPAR-β对脓毒症肝损伤是否有保护作用。本实验以脓毒症肝损伤最为严重的12h为主，在4组小鼠中，LPS组电泳条带面积较Sham组增大；LPS+GW0742组条带面积较LPS组减少；LPS+GSK0660组条带面积与LPS组无明显差距,详见图8。在12h,Sham组可见少量TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB蛋白表达；LPS组TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB蛋白表达含量均高于Sham组，差异有统计学意义(P=0.000)；LPS+GW0742组蛋白含量表达低于LPS组，差异有统计学意义(P=0.000)；LPS+GSK0660组蛋白含量表达与LPS组比较，差异无统计学意义(P>0.05,表2)。

图8 各组小鼠蛋白表达含量情况比较1.假手术组；2.LPS组；3.LPS+GW0742组；4.LPS+GSK0660组

表2 各组小鼠蛋白情况表达情况比较

Sham.假手术组；LPS.脓毒症肝损伤组；LPS+GW0742.脓毒症肝损伤+激动剂组；LPS+GSK0660.脓毒症肝损伤+抑制剂组

讨 论

本研究采用小鼠实验动物模型，通过观察不同组别脓毒症小鼠6、12、24h肝脏的损伤情况，并分别从血清学、组织学、分子生物学等多个角度进行分析，探讨PPAR-β对小鼠脓毒症肝损伤的作用。

血清学实验研究结果显示,小鼠腹腔注射LPS后，从6h开始，ALT、AST和TBIL水平均显著升高，12h达到最高水平，24h数值逐渐减低，表明LPS对小鼠产生了炎性反应，发生了肝损伤，与既往研究结果一致[18～20]。且数值随时间变化而变化，在6h开始升高，12h达到高峰，24h开始降低，表明脓毒症肝损伤在12h最为严重。LPS+GW0742组ALT、AST和TBIL水平与LPS组比较，在6、12、24h均显著降低，而LPS+GSK0660组与LPS组比较，在6、12、24h基本无变化，表明使用特异性配体激活PPAR-β表达后，可以减轻肝损伤，而使用特异性配体抑制PPAR-β表达后，不能减轻肝损伤，表明内源性激动剂增加 PPAR-β表达后，可以通过抑制环氧酶(cyclooxygenase，COX)活性，减少氧自由基的释放，减轻肝脏氧化应激损伤，对小鼠脓毒症肝损伤有一定的保护作用，与既往研究结果一致[15]。提示在脓毒症治疗过程中，前6h为治疗的黄金时间，尽早使用有效的药物治疗，可以减轻脓毒症的炎性反应。LPS组炎性因子表达均高于Sham组；而LPS+GW0742组炎性因子表达低于LPS组；LPS+GSK0660组表达与LPS组无明显差距，表明PPAR-β被特异性激动剂激活后，可以抑制NF-κB活性，减轻TNF-α等炎性因子的表达，与既往研究一致[16]。

综上所述，脓毒症小鼠高表达TNF-α、IL-1β、IL-18、csapase-1、NF-κB，PPAR-β可通过抑制环氧酶 (cyclooxygenase，COX)活性，减少线粒体氧自由基的释放，并通过下调NF-κB分子的表达及炎性因子的产生，从而减轻小鼠脓毒症肝损伤。而最新研究已证实，PPAR-β可以促进β氧化, 降低甘油三酯和游离脂肪酸的循环水平,有加快脂肪酸的分解代谢、改善胰岛素的敏感度及炎症的抑制作用。本研究不足之处为仅对肝损伤最为严重的12h进行蛋白含量测定表达，下一步将对其他时间段进行测量，并将结合细胞学实验及从降低脂肪酸水平等开展多方面机制研究，有望为脓毒症的治疗提供新的靶点。