冬青坐浴剂对肛瘘术后创面新血管形成及VEGF表达的影响*

李兵剑，朱成斌，谢 军

(湖南省衡阳市中医医院 肛肠科，湖南 衡阳 421001)

肛瘘是一种常见的肛肠科疾病。迄今为止，手术治疗加术后换药仍然是治疗肛瘘的主要模式。但由于肛瘘发病部位特殊，创面局部污染严重，为避免继发感染，创面往往不予缝合，而是通过肉芽填充组织的缺损使其自行愈合。因而这一过程较为漫长，给患者带来了较长时间的肉体上的痛苦及精神上的负担，也给医生带来了极大的困扰。如何缩短病程是摆在医生面前亟待解决的课题。冬青坐浴剂是我科肛瘘术后常用的外用熏洗剂，既往研究[1]表明，冬青坐浴剂可明显缩短伤口愈合时间。本研究旨在通过研究冬青坐浴剂对创面新血管形成及VEGF表达的影响来揭示其作用机理，为深入研究奠定基础，现将研究状况报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

90例患者均为2017年7月～2018年6月我院肛肠科接受“肛瘘切除术”的住院病例，将其随机分为观察组、对照组，各45例。其中观察组男25例，女20例；年龄 20岁～65岁，平均(39.2±4.1)岁；病程(1.8±0.2)a；创面纵径(3.3±1.2)cm。对照组中，男23例，女22例；年龄19岁～65岁，平均(40.8±3.8)岁；病程(1.5±0.3)a；创面纵径(3.2±1.1)cm。两组患者基本资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有入组者均签署知情同意书。

1.2 诊断标准

依据2006年制定的《肛瘘临床诊治指南》中“低位单纯性肛漏”诊断标准[2]评定。内口在肛隐窝，仅有一个瘘道经外括约肌皮下部或浅部与皮肤相通。入选的患者需排除特异性肛瘘(如肿瘤、糖尿病、白血病、溃疡性结肠炎、Crohn病所致肛瘘)，合并严重心脑血管疾病、过敏体质及疤痕体质、妊娠和哺乳期妇女及精神病患者亦不纳入。

2 治疗方法

所有患者均在腰俞麻醉复合局麻下行肛瘘切除术。切口呈上窄下宽的“球拍型”开放创面，创面纵径2.5 cm～4.0 cm。术后酌情运用抗生素。手术次日开始采用药物熏洗及专科换药。

观察组应用冬青坐浴剂熏洗坐浴，对照组应用高锰酸钾溶液，每次坐浴15 min/次，每天2次，保持药液温度38 ℃～45 ℃。坐浴后均用玉红生肌膏换药。药物配置：冬青坐浴剂由我院制剂室提供，每袋标准剂量为50 g，用2 000 mL开水充分溶解；高锰酸钾(济南康福生制药有限公司,批准文号：HB7022233)，按1∶4 000 的比例使用，即每次5片，用2 000 mL开水充分溶解。

3 疗效分析

3.1 疗效指标

3.1.1 微血管计数(MVD)

术后第8天、14天分别用眼科剪剪取创面1.0 mm×1.0 mm新鲜肉芽组织，用10 % 缓冲福尔马林溶液固定，经脱水及石蜡包埋后，行5 μm连续切片后保存。然后用抗CD 31单克隆抗体对组织标本进行免疫组化染色。先在低倍镜(×40)下选择微血管密度最高的3个区域，然后在高倍镜(目镜×10，物镜×20)下计数3个视野的微血管数，取其平均数为该标本的微血管数。

3.1.2 组织VEGF表达定位

采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P法)，按照试剂盒说明书进行免疫组化染色。石蜡切片脱蜡，3 %H2O2室温孵育，然后抗原微波热修复，5 %～10 %正常山羊血清封闭非特异性位点，倾去血清，添加VEGF一抗工作液(稀释比为1∶200)，37 ℃孵育过夜，滴加二抗工作液，然后采用DAB染色，苏木素复染，最后封片。先在低倍镜(×40)下选择3个阳性细胞(阳性细胞呈清晰棕黄色颗粒)密度最高的区域，然后在400倍视野下进行计数，依据镜下阳性细胞数占细胞总数的百分比(标记指数LI)综合判定。标记指数小于25 %为弱表达或不表达(-)；25 %～50 %为弱阳性表达(+)，51 %～75 %为阳性表达(++)，大于75 %为强阳性表达(+++)。

3.1.3 计算创面的收缩率

于治疗后第8天、14天采用透明胶片描记测定局部创面面积，评价记录各组创面动态愈合率。创面愈合百分率(%)=(原始面积-测量时创面面积)/原始面积×100 %。

3.2 统计学方法

3.3 治疗结果

3.3.1 两组患者创面新生毛细血管数量比较

经t检验，观察组第8天，第14天创面毛细血管计数明显多于同期对照组(均P﹤0.05)。14 d时两组患者视野内平均血管计数均明显高于第8天(t值分别为10.43、11.86，P﹤0.05)。结果：提示冬青坐浴剂可促进创面毛细血管增生，其效应高于高锰酸钾。见表1。

表1 两组患者创面新生毛细血管数量比较

3.3.2 两组患者创面肉芽组织中VEGF表达水平比较

治疗后第8天、14天观察组VEGF表达明显高于对照组(u值分别是2.03、1.44，均P<0.05)。第14天两组患者VEGF的表达情况明显高于第8天(u值分别是3.08、2.96，P均<0.05)。结果：提示冬青坐浴剂可促进创面肉芽组织中VEGF的高表达，其效应高于高锰酸钾。见表2。

表2 两组患者创面肉芽组织中VEGF表达情况比较

3.3.3 两组患者创面缩小率的比较

治疗后第8天及第14天，观察组的创面缩小率明显高于对照组(t值分别为-3.11、-3.68，均P<0.01)。结果：提示冬青坐浴剂能促进伤口愈合，加快创面愈合率，其效应高于高锰酸钾。见表3。

表3 两组患者创面愈合率的比较

4 讨 论

在目前，肛瘘的治疗主要取决于手术治疗，然而，由于发病部位的特殊性，肛瘘术后的创面不缝合，让伤口充分敞开，暴露，依靠肉芽组织的填充，使伤口二期愈合。这种创面二期愈合的过程是血管内皮细胞和成纤维细胞增殖分化，进而纤维蛋白合成、重组，新生血管的形成以及表皮细胞增生覆盖创面的过程[3]。其中，创面新生毛细血管的多寡对于伤口的愈合起着极其重要的作用：丰富的血运，则可有效提高创面新陈代谢的速度，为组织提供足够的氧供与营养，促进伤口愈合[4]。然而这种自然愈合过程，耗费的时间过长，影响患者的工作及生活，此外，每日常规的换药对伤口的刺激造成的疼痛降低了患者的满意度[5]。为此，在开放性创面与伤口愈合之间，寻找一种能加速创面愈合的方式，成为一种迫切的需求。

中国传统医学在创伤愈合方面有着非常丰富的经验，提出了“箍围消散，祛腐生肌，生肌收口”三大中医外科治疗原则[6]，并在此原则基础上，依据中医基本理论，制定了许多有名的外用制剂，譬如“五倍子洗剂”“橡皮生肌膏”等。中药方剂、坐浴药袋、熏洗方、膏剂对术后局部创面血液循环均有明显的促进作用，可快速消除切口水肿，减轻疼痛，缩短患者修复时间[7]。近年来，发表的许多文献均证实中药外用伤口愈合的确切疗效[8～10]。

冬青坐浴剂是我院的传统协定处方，临床应用20 a余，由毛冬青、玄明粉、丹皮、鱼腥草、槐花、防风、乳香、没药等药组成。其中毛冬青具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒之功效，可扩张血管、加速血液循环、抗菌消炎、有效控制感染部位局部炎性分泌物及祛腐、止痛、生肌、促进新鲜肉芽组织生长、加速切口愈合等作用[11～12]；鱼腥草具有清热解毒的功效，其多酚及其苷类、黄酮和黄酮苷类是鱼腥草中主要抗炎活性成分[13]，对肛瘘创面可起到抗感染、缩短炎症反应时长的功效；玄明粉、丹皮、槐花具有清热凉血化瘀、消肿止痛的功效；乳香及没药具有活血止痛、消肿生肌的功效，是历代各种生肌散方剂中最常用的配伍单元[14]，在对肛肠术后创面愈合治疗效果的考察中，其外敷治疗的创面愈合速度、止痛效果都优于常规处理，并可缩减疼痛时间[15]；防风祛风胜湿，解痉止痛，现代药理研究发现，其主要化学成分为升麻素苷和5-0-甲基维斯阿米醇苷，具有抗炎、镇痛、抗凝血、调节机体免疫功能等药理作用的作用[16]。诸药合用，具有清热解毒、活血化瘀、消肿止痛生肌的功效。既往研究显示：通过该方坐浴，可减少肛瘘创面炎性反应，缩短愈合时间，缓解疼痛，加速创面愈合。有研究证实[17]，中医药可多靶点、多层次发挥综合调控作用，促进创面修复。

本次研究发现，冬青坐浴剂熏洗坐浴后，肛瘘创面肉芽组织生长速度及创面的缩小率明显快于高锰酸钾坐浴组。创面愈合与局部丰富的血运与氧供是极其相关的。术后VEGF等细胞因子的活化与高表达可激活血管内皮细胞，从而促进血管新生[18]。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，在受体的作用下，通过与内皮细胞高亲和力结合，可起到两方面的作用：一是直接刺激血管内皮细胞，使其增殖，并诱导其迁移和形成管腔样结构；二是通过增加微血管通透性，引起以纤维蛋白原为主的血浆蛋白外渗，进而诱导间质产生而促进体内新生血管生成[19]。从本研究看，观察组在术后第8天及第14天其VEGF的表达均高于对照组(均P<0.05)，同时发现，观察组第8天及第14天创面毛细血管计数明显多于同期对照组(t值分别为3.48、-3.05，P均﹤0.05)，观察组的创面缩小率明显快于对照组。以上说明，VEGF在创面中的高表达与创面毛细血管的增生及伤口的愈合之间有着内在的关联性。

本次研究中，从临床研究方面观察到冬青坐浴剂主要通过提高创面VEGF的表达，改善创面缺血、缺氧的状态，进而促进伤口的愈合。然而，创面愈合是多机制，多途径的，是否存在其他方面的效应靶点，仍有待于我们进一步去探索。