1株蚕沙高温腐熟菌的筛选及应用

李秀玲　辛磊　安慧　覃勇荣

摘要：为寻找高效的高温腐熟菌用于蚕沙的无害化处理，从蚕沙倾倒地筛选到1株菌株CP2，该菌株纤维素酶活性达到136.67 U/mL。将该菌株接种到蚕沙中进行堆肥试验，通过检测堆肥过程中堆体的温度、含水率、pH值、有机质含量、全氮含量、碳氮比及种子发芽指数等指标评价菌株CP2的应用效果。结果表明，试验组较对照组更能提高堆体温度、延长高温期、降低堆体含水量、促进有机质分解、降低碳氮比;试验组种子发芽指数在腐熟25 d时已达到88%，高出对照组15百分点;以上结果说明，加入CP2菌株进行堆肥，可加快蚕沙腐熟并提高堆肥品质。

关键词：蚕沙;纤维素降解菌;堆肥;高温腐熟;CP2菌株

中图分类号：S141.4;S182文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0314-04

收稿日期：2018-06-09

基金项目：河池学院硕士专业学位授予单位立项建设基金（编号：2016HJA006）。

作者简介：李秀玲（1983—），女，山东泰安人，硕士，讲师，主要从事固体废弃物的资源化应用研究。E-mail：lixiuling0606@163.com。

通信作者：覃勇荣，博士，教授，主要从事石漠化生态修复研究。E-mail：1595677337@qq.com。

随着我国新农村建设的速度日益加快，固体废弃物的资源化利用受到高度重视[1]。农村固体废弃物总体而言主要包括日常的生活垃圾、农林废弃物及畜禽粪便等[2]，产生量大、成分复杂且含有有机物质。如果处理得当，这些物质会变成富含养分和有机质的优质肥源;如若处理不当，势必会造成环境的二次污染[3]。

我国种桑养蚕历史悠久，种植面积、养蚕数量及蚕丝出口量一直保持世界领先水平。蚕沙作为养蚕行业的主要副产物之一，产量巨大并含有丰富的氮、磷、钾及微量元素和有机质[4]，是一种优质的有机源。蚕农多是将蚕沙以及病死蚕在不处理的情况下直接回施于桑园，代替有机肥使用，但蚕沙不仅隐藏有大量的病原菌，而且含有大量的難以降解的纤维素，不经处理会提高蚕病发生概率及严重程度，且会对桑园土质造成破坏，直接或间接给蚕农造成不可估量的损失，因此蚕沙的资源化利用一直被业界关注[5]。

我国“东桑西移”工程的实施，使广西壮族自治区尤其是河池市宜州区的种桑养蚕数量保持数年全国第1，在2018年宜州区更是被我国蚕学会授予“中国蚕桑之乡”称号，因此宜州区每年养蚕所产生的蚕沙数量非常大，其中所存在的问题亟待解决。本研究从宜州区当地的蚕沙倾倒地采集样品，从中分离出纤维素降解菌，经滤纸条降解试验及产酶活性测定等研究，确定该菌株的纤维素酶活性，进一步通过研究堆体的温度、碳氮比、发芽指数等确定该菌对蚕沙的腐熟应用效果，以期筛选到适合当地应用的菌株，为广西蚕沙的综合利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

试验样品采自广西壮族自治区河池市宜州区蚕沙倾倒地的腐殖土。

1.1.2 培养基

LB培养基：蛋白胨10 g，酵母浸出粉10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。羧甲基纤维素钠（CMC）培养基：CMC-Na 15.0 g，NH4NO3 1.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO4 1.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 000 mL。纤维素刚果红培养基：K2HPO4 0.50 g，CMC-Na 2.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，明胶2.00 g，刚果红0.20 g，琼脂15.00 g，蒸馏水1 000 mL。赫奇逊培养液：KH2PO41.00 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，CaCl2 0.10 g，NaCl 0.10 g，FeCl30.01 g，NaNO3 2.50 g，pH值7.2～7.3，蒸馏水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 高温纤维素降解菌的筛选 （1）初筛过程：取10 g样品加入含有玻璃珠的90 mL无菌水中，采用漩涡振荡器振荡摇匀，取1 mL加入9 mL无菌水中，依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个稀释度，取10-6、10-7、10-8等3个稀释度溶液各200 μL 涂布于CMC培养基上，每个梯度设3个重复，置60 ℃培养箱中培养，待菌落长出后挑取外形不同的单菌落划线培养，备用。（2）复筛过程：将初筛菌株接种在纤维素刚果红培养基上，每个菌株3个重复，置于培养箱中培养后，测量透明圈直径（D）与菌落直径（d）的差值，初步判断所筛选菌株降解纤维素的能力大小。

1.2.2 滤纸条降解试验

将1 mL筛选得到的降解菌发酵液接种到装有50 mL赫奇逊培养液的三角瓶中，瓶中放置1 cm×6 cm的新华Ⅰ号滤纸条，每个处理3个重复，设不加菌液的滤纸条作为对照，置于32 ℃ 180 r/min恒温摇床上、振荡培养5 d，观察各瓶中滤纸条溃烂情况[5]。

1.2.3 纤维素酶活性测定

参照NY/T 1847—2010《微生物肥料生产菌株质量评价通用技术要求》[6]中规定的方法测定纤维素酶活性。在25 mL具塞试管中加入滤纸条、1 mL柠檬酸盐缓冲液和2 mL DNS试剂处理后，用蒸馏水定容至25 mL，测定540 nm 下的吸光度，对照标准曲线计算酶活性，以蒸馏水代替发酵液为对照。在50 ℃、pH值为5.5条件下，以1 min内1 mL样品降解滤纸产生1 μg葡糖糖为1个酶活性单位（IU）。

1.3 堆肥试验

1.3.1 纤维素降解菌发酵液制备

将“1.2.1”节中筛选到的菌株接种到LB培养液中进行摇瓶培养，培养完毕后将该菌液混匀，采用平板涂布法计数，确保有效活菌数为1亿个/mL，备用。

1.3.2 蚕沙堆肥处理

从宜州区当地的蚕农家收集蚕沙，分为试验组和对照组，试验组添加“1.3.1”节中制备的菌液，对照组添加同等量的无菌水，确保含水率为60%，每组设2个重复，每个重复50 kg蚕沙。添加菌液和无菌水后，将堆体混合均匀，置于河池学院温室大棚中，并加盖黑色塑料布，4 d翻堆1次，堆肥时间为2017年6月30日至7月29日，为期30 d。

1.3.3 温度测定

以堆体中心处为测量点，每天10：00和17：00测定温度，取平均值作为堆肥温度，同时测定环境温度。

1.3.4 蚕沙发酵前后理化指标测定

以堆体四周对称的4个点为采样点，采样深度为20 cm，各点采样50 g，混合后备用。对堆体腐熟前后的含水率、pH值、有机质含量、全氮含量等理化指标进行测定。堆体含水率测定采用常压干燥法。pH值测定：将样品与蒸馏水按1 ∶10（质量浓度）比例混合，配制成蚕沙悬浊液，室温180 r/min振荡1 h后静置，用pH计测定上清液pH值。有机质含量的测定采用重铬酸钾-浓硫酸氧化比色法。全氮含量采用H2SO4-H2O2消煮、奈氏比色法测定[7]。

1.3.5 堆肥处理的种子发芽指数测定

参照黄国锋等的方法[8]进行种子发芽指数测定。称取不同腐熟时间的堆肥样品10 g，加入蒸馏水100 mL，充分振荡后过滤，吸取滤液10 mL 置于铺有双层滤纸的培养皿中，在滤纸上均匀摆放10粒白菜种子，置于25 ℃培养箱中培养48 h后，计算发芽率（GI），设置3次重复，对照为蒸馏水。种子发芽率的计算公式为GI=（堆肥浸提液处理的种子发芽率×堆肥浸提液处理的种子根长）/（蒸馏水处理的种子发芽率×蒸馏水处理的种子根长）×100%。

1.4 统计方法

试验数据采用SPSS 20数据分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 高温纤维素降解菌的筛选

经过初筛，共得到8株高温纤维素降解菌，编号为CP1、CP2、CP3、CP4、CP5、CP6、CP7、CP8;将8株菌株进行复筛培养后，分别测量透明圈直径和菌落直径，计算平均值。结果表明，有5株菌株产生了透明圈，其中CP2产生的透明圈直径最大，透明圈直径与菌落直径的差值也最大，数据如表1所示。统计分析表明，CP2菌株的透明圈直径与其他菌株存在显著性差异;而CP2菌株的菌落直径除与CP8菌株不存在显著性差异外，与其他菌株均存在显著性差异。

2.2 滤纸条降解试验

将筛选到的5株菌株进行滤纸条降解试验，结果（表2）表明，CP2菌株对滤纸条的降解效果最好，滤纸条变为糊状，其他4株菌株处理下的滤纸条均未达到糊狀。

2.3 纤维素酶活力测定

将筛选到的5株菌株进行纤维素酶（滤纸酶）活性测定，结果见表3，CP2菌株的纤维素酶活性高于其他4株菌株，达到136.67 U/mL;其次为CP3菌株，纤维素酶活力为68.69 U/mL;其他3株菌株的酶活性均较低。通过该试验可以看出，滤纸条降解试验及酶活性测定试验结果基本一致。经统计分析表明，除CP1与CP8菌株不存在显著性差异外，其余菌株均存在显著性差异。

2.4 堆肥试验

2.4.1 堆肥过程的温度变化

温度是堆肥无害化的重要指标，可直接反映堆体内微生物活性的变化及有机物的转化情况，因此堆体温度可直观、快速地评价堆肥腐熟程度[9]。微生物在分解蚕沙中有机质的同时，会产生大量的热量，导致堆温上升。50 ℃以上堆温保持持续5 d以上，能够有效地杀灭蚕沙中的致病菌，是保证堆肥无害化的重要条件[10]。从图1可以看出，试验组和对照组的堆体温度都呈现先上升后下降的趋势，试验组在堆肥6 d时达到最高温（65 ℃），其温度上升速度及最高温度都优于对照组，且高温（>50 ℃）持续19 d，比对照组延长了4 d左右，符合堆肥无害化的卫生标准。在堆肥说明加入CP2菌株后可加速堆体升温，使堆体提前进入高温期，且持续时间更长，有利于堆肥的腐熟。

2.4.2 堆肥过程中各理化指标变化

2.4.2.1 堆肥过程中含水率变化

堆肥过程中含水率总体呈下降趋势，微生物的代谢、堆温等都会对含水率产生影响。从图2可以看出，试验组和对照组的含水率均呈现下降趋势，在高温阶段含水率下降最快，这是由于高温有利于水分的蒸发。随着温度的下降，含水率的下降幅度也随之放缓，最后试验组水分降低50%，达到30%，符合有机肥对水分的要求。试验组比对照组的含水率在高温期下降更快，降低幅度高出8%，说明加入CP2菌株在增加堆体温度的同时，也可更好地降低堆体的含水率。

2.4.2.2 堆肥过程中pH值变化

在堆肥过程中，伴随着含碳有机物被微生物分解产生有机酸和含氮有机物被分解产生氨，堆体的pH值也会随之发生变化。从图3可以看出，在堆肥的初始阶段，含碳有机物分解产生有机酸，造成pH值下降;随着堆体温度上升、含水率下降，含氮有机物分解产生氨气，使堆体pH值开始上升;后期随着氨气的减少以及微生物的降解活动产生大量H+，堆体的pH值又开始回落。至堆体腐熟完毕，其pH值基本稳定在碱性范围内。试验组最后的pH值为7.9，对照组为8.1，均符合有机肥规定的pH值为5.5～8.5的标准。在试验过程中，试验组的pH值下降和上升趋势与对照组基本一致，其下降和上升幅度大于对照组，说明加入CP2菌株（试验组）有利于堆体中有机物的分解。

2.4.2.3 堆肥过程中有机质含量的变化

有机质是来源于生命的物质，是微生物生存的基本物质。堆肥过程一方面可使微生物将有机物降解成矿物质、二氧化碳、水和热量等而使有机质含量降低[11];另一方面，有机物在降解过程中转化成稳定的腐殖质，最终使有机质含量趋于稳定。当有机质含量低时，堆肥腐熟过程无法产生足够的热量来满足堆肥对温度的需要，无法达到腐熟的指标和效果，因而会影响堆肥的肥效;有机质含量过高则对堆肥通风供氧要求较高，若达不到微生物生长对氧的需求，则会导致堆体局部厌氧释放臭气。

蚕沙中含有大量的有机质，含量在87%左右。从图4中可以看出，随着腐熟天数的增加，有机质含量逐渐下降。试验组从堆肥5 d时开始有机质含量就出现大幅的下降，到20 d时由最初的87%降低到61%左右，而对照组的有机质含量也发生了下降，但下降幅度较试验组小，只降低到了70%左右。说明试验组加入CP2菌株后，加速了蠶沙中有机物的分解，到堆肥结束时，堆肥的有机质含量基本维持在相对稳定的水平。

2.4.2.4 堆肥过程中全氮含量变化

氮素是微生物生长繁殖的主要条件之一，微生物在降解有机物的同时也会影响全氮的含量[12]。从图5可以看出，试验组和对照组的全氮含量在腐熟的前10 d呈现下降趋势，10 d后又逐渐上升，最后稳定在3.21%左右。原因是堆肥腐熟的初始阶段，在微生物的作用下有机氮分解转化成挥发性氮而导致氮含量下降，但是随着挥发性有机物的分解转化，堆体的体积和质量均降低，造成全氮含量的绝对值有所下降而相对值却有所上升。

碳氮比是堆肥腐熟的重要指标，初始腐熟的碳氮比为 （25～30 ）∶1，这是腐熟的理想状态，而碳氮比到达20 ∶1以下时认为腐熟完成[13]。结合图4和图5来看，堆体的初始碳氮比为29 .0∶1，到腐熟完成，试验组的碳氮比为18.7 ∶1，对照组为21 .0∶1，说明在相同的时间内，加入CP2菌株缩短了堆肥的腐熟时间，也提高了堆肥的腐熟效果。

2.4.3 不同时期的堆肥发芽指数测定

种子发芽试验可检验堆肥的腐熟水平。种子发芽指数>50%表示堆肥基本腐熟;指数达到80%以上则表示堆肥完全腐熟[14]。从图6可以看出，试验组腐熟15 d后，其种子发芽指数已达到51%，说明堆肥基本腐熟，比对照组提前了3 d;试验组腐熟到25 d时，其种子发芽指数达到88%，说明堆肥已完全腐熟，而此时对照组为73%。说明加入CP2菌株能够加快堆肥的腐熟进程。

3 结论与讨论

堆肥是包含一系列生化反应的复杂体系，是在微生物参与下通过高温发酵使有机物矿质化、腐殖化和无害化而变成腐熟肥料的过程[15]，利用高温腐熟菌来处理固体废气物，可提高腐熟温度、缩短堆肥周期、提高腐熟度，这已被广泛证实[16]。

自然界中大部分细菌、真菌、放线菌及原生动物均可产生纤维素酶，因细菌培养简单、易分离，研究较多。蒋明星等从朽木周围的土壤中筛选到3株活性较高的纤维素降解细菌并优化了产酶条件[17];罗奉奉等从桑园土壤中筛选到的YZB46菌株，葡萄糖酶活性达到17.08 U/mL[18];冯红梅等筛选的复合菌群酶活性达到135.9 U/mL[19]。本试验筛选到的CP2菌株，产酶活性达到136.67 U/mL，优于许多已报道的细菌菌株，甚至达到复合菌群的酶活性，且远超农业农村部对微生物肥料中纤维素降解菌产纤维素酶活性（70 U/mL）的规定。将该菌株发酵后接种到蚕沙中进行堆肥试验，结果表明，添加CP2菌株后试验组堆体最高温度可达到65 ℃，高温持续时间比对照组长4 d左右。试验组和对照组的含水率均出现下降趋势，但试验组的含水率在高温期下降更快，降幅比对照组高出8%;试验组和对照组的有机质含量随着腐熟的进行逐渐下降，最终试验组的有机质含量降低到61%左右，低于对照组;堆体的碳氮比起初为29.0 ∶1，腐熟完成后，试验组降低到18.7 ∶1，而对照组为21.0 ∶1;试验组种子发芽指数在腐熟25 d时已达到88%，高于对照组的73%，说明堆肥较对照组更快地达到完全腐熟。以上试验表明，加入CP2菌株可以加快蚕沙的腐熟进程，提高堆肥的质量。

随着研究的深入，单一菌株已无法满足正常生产的需要，研究重点也逐渐转向复合菌剂，相比较而言，复合菌剂可更快地增加功能菌株的数量、改善堆肥中微生物的群落结构，加强各菌株之间的协同作用，从而缩短堆肥腐熟的时间和提高腐熟度[20]。后续研究将在本研究的基础上寻找多株高温腐熟菌，并进行优化配制，构建功能更加完善的复合菌剂，进而为广西壮族自治区蚕沙的无害化处理提供更有效的方法。

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