硅胶干燥对棕榈科植物DNA提取效果的影响

吴翼 刘蕊 郭爱汕 李静 杨耀东

摘要：應用硅胶干燥法对棕榈科3个不同属作物椰子、油棕和槟榔的叶片经干燥处理后置于不同温度条件下保存3个月，以新鲜叶片为对照，采用简易十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取基因组DNA，分析硅胶干燥处理后对DNA提取效果的影响。研究结果表明，硅胶干燥法处理的叶片提取的基因组DNA质量较好，与对照无明显差异，完全可以应用于后续的分子生物学研究。硅胶干燥法处理的叶片在常温条件下保存即可达到后续试验的要求，这为今后棕榈科植物试验材料的中短期保存提供了新的途径。

关键词：棕榈科植物;硅胶干燥;DNA提取;椰子;油棕;槟榔

中图分类号： S590.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0083-03

收稿日期：2018-08-31

基金项目：中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金（编号：1630152017019、1630152017007）。

作者简介：吴 翼（1980—），男，海南文昌人，硕士，助理研究员，主要从事热带作物遗传育种研究。E-mail：wuyi-scuta@163.com。

通信作者：杨耀东，博士，副研究员，主要从事热带作物遗传育种研究。E-mail：yyang8@qq.com。

棕榈科植物是单子叶植物中一个非常有特色的植物类群，全世界共有200多属3 000余种，主要分布于热带和亚热带地区。原产于美洲、澳洲的棕榈科植物种类最多，约有100属1 400种，少数原产于非洲和欧洲[1]，原产于我国的有18属117种，主产地为云南、广东、海南、广西、台湾、福建、四川、湖南、江西、贵州，西藏的一些温暖地区也有分布[2]。

提取完整的基因组DNA是分子生物学研究的起点。野外采集叶片材料时往往很难及时带回实验室进行低温保存而使材料发生褐变，严重影响DNA的提取效果。硅胶脱水干燥法保存植物样品操作方便，不受时间限制，已在多种作物中应用[3-9]，均取得较好的效果，而在棕榈科植物上的应用未见报道。本研究对棕榈科植物椰子、油棕和槟榔的叶片分别采用硅胶脱水干燥后置于25 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存3个月，以新鲜叶片为对照，采用简易十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法对3种不同处理的样品进行基因组DNA提取效果的比较分析，探讨硅胶干燥叶片对棕榈科植物DNA提取的影响，以期为今后棕榈科植物材料的长期保存提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以椰子、油棕和槟榔3种棕榈科植物为试验材料，均采自中国热带农业科学院椰子研究所种质圃。取完全展开的新鲜叶片，用变色硅胶干燥后置于25 ℃（常温）、-20 ℃和-80 ℃ 保存3个月后提取基因组DNA，同时以新鲜叶片为对照（CK）。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取方法 采用CTAB法，参考吴翼等的方法[10]，具体步骤：（1）取约2 g幼叶新鲜材料或约1 g干燥材料在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，转入15 mL离心管中，加约5 mL提取液，摇匀，置于冰上，将所有材料研磨完后，进行下一步操作。（2）离心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），弃去上清（小心管内粉末）。再次加入约5 mL提取缓冲液，摇匀，离心（5 min，8 000 r/min，4 ℃），小心弃去上清。（3）在管中加入5 mL 65 ℃预热的裂解液，摇匀。65 ℃水浴90～120 min，每30 min 摇1次。（4）裂解后冷却2 min，加等体积三氯甲烷+异戊醇（体积比24 ∶1）抽提液，摇匀（摇50次左右，再涡旋约2 min）至乳浊液。15 min、8 000 r/min、25 ℃离心。（5）吸取上清，转入新的15 mL离心管，加入0.6倍体积的冰冻异丙醇和0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH值5.2），缓慢摇匀至沉淀析出。（6）将离心管离心（3 min，8 000 r/min，25 ℃）。再将沉淀转入2 mL离心管，用70%乙醇1 mL洗涤2次。加70%乙醇1 mL浸泡过液。（7）去盐离子及可溶于乙醇的杂质：次日，用70%乙醇1 mL洗1次，自然风干或者离心干燥后加0.7 mL的灭菌水溶解。（8）加等体积酚+三氯甲烷+异戊醇（体积比25 ∶24 ∶1）抽提液，冷却2 min，摇匀（约50次后再涡旋30 s），离心（15 min，8 000 r/min，25 ℃）。（9）取上清加等体积三氯甲烷+异戊醇（体积比24 ∶1）抽提液，冷却后，摇匀（约50次后再涡旋30 s），离心15 min，8 000 r/min，25 ℃。（10）吸取上清，加入2倍体积的冰冻乙醇和0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠（pH值5.2），缓慢摇匀至沉淀析出。-20 ℃下放置1 h以上。（11）离心（3 min，8 000 r/min，25 ℃），用0.1 mL枪头吸干，再用70%乙醇洗2次（去盐离子）。尽可能吸干净乙醇，自然风干或者离心干燥至DNA略有潮湿，用TE（根据DNA多少确定用量）溶解，-20 ℃保存备用。

1.2.2 DNA检测方法 （1）紫外分光光度计检测。取2 μL DNA样品加ddH2O稀释50倍至100 μL，用紫外分光光度计测定D230 nm、D260 nm、D280 nm以及D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值，判断DNA的纯度;再根据公式计算DNA样品浓度，具体公式：DNA样品浓度=D260 nm×稀释倍数×50/1 000。（2）2%琼脂糖凝胶电泳检测。取出一定量的DNA，稀释成100 ng/μL，取8 μL在2%琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统下观察、拍照，根据λ-DNA判断基因组DNA的分子质量和大小。（3）简单重复序列（SSR）-PCR扩增检测。分别以所提取的DNA为模板进行SSR-PCR扩增。所用SSR引物Co107的序列分别为5′-CAGTAGTGCCCAAGAATAGA-3′和5′-TGCGTCACACACACACAG-3′，由Bioneer公司合成;25 mmol/L MgCl2、4×10 mmol/L dNTPs、5 U/μL Taq DNA 聚合酶、10×Taq Buffer均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。PCR扩增在TaKaRa-TP 600扩增仪上进行，其扩增体系与扩增程序如下：总体积为20 μL，其中10×PCR Buffer 20 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）0.5 μL，SSR引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶1 U，MgCl2（25 mmol/L）1.5 μL，模板DNA（20 ng/μL）2 μL。扩增程序如下：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸45 s，25个循环; 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 紫外分光光度法检测结果

CTAB法提取的DNA沉淀呈透明胶状，没有酚类氧化或其他色素造成的污染。由表1、表2、表3可见，DNA溶液的D260 nm/D280 nm值大部分为1.70～1.90，D260 nm/D230 nm值在2.0左右，进一步说明提取的DNA较纯，RNA较少，多糖、蛋白质、酚类等杂质污染也较少。与对照组（CK）相比，硅胶干燥处理的叶片所提取的DNA的D260 nm/D280 nm值和D260 nm/D230 nm值较接近，无明显差异。

2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果

根据琼脂糖凝胶电泳结果（图1、图2、图3）可以看出，3种棕榈科植物材料提取的DNA条带整齐、清晰、无明显弥散现象，表明DNA完整性较好，降解较少。点样孔亮度微弱，表明提取到的DNA纯度高，蛋白质、酚类及多糖类等杂质去除得较彻底。由图1和图2可知，椰子、油棕各个处理所提取的DNA纯度都较好，条带整齐、清晰，与λDNA接近。硅胶干燥处理的叶片所提取的DNA（泳道4～12）与对照组（泳道1～3）无明显差异;图3显示，槟榔各个处理的DNA条带均暗于λDNA，硅胶干燥处理的叶片所提取的DNA（泳道4～12）均略有降解现象，相比对照组（泳道1～3）DNA质量差。

2.3 基因组DNA的PCR扩增结果

用SSR引物Co107对所提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。由图4可知，3种棕榈科植物的不同处理所提取的DNA均获得了清晰的扩增条带。从硅胶干燥处理样品中提取的DNA与从鲜叶中提取的DNA采用同一引物扩增，所得谱带基本无差异。

3 讨论

CTAB是一种强去污剂，能溶解细胞膜，还能有效地去除糖类杂质。目前此法已经被广泛地应用于植物基因组DNA的提取。本研究结果进一步表明，CTAB法不仅适合椰子、油棕和槟榔等棕榈科植物新鲜叶片的DNA提取，同时也适合棕榈科植物硅胶干燥叶片的DNA提取。

本研究在DNA提取的过程中发现，新鲜叶片在研磨時较干燥叶片更容易些;新鲜叶片在研磨完成时须快速转入离心管中，并添加含有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和β-巯基乙醇的提取液，否则容易引起褐化，而干燥叶片研磨后也不易褐化，这与何天明等的研究结果[6]相同;新鲜叶片置冰箱冷冻后取出，有冻伤现象，出现水渍状，而干燥叶片无此现象。

紫外分光光度计检测结果表明，从硅胶干燥处理的叶片样品中提取的DNA，纯度较高，其D260 nm/D280 nm值为1.70～190，D260 nm/D230 nm值约为2.0，与从新鲜叶片样品中提取的DNA无明显差异，这与李学营等的研究结果[4，7，11]相似，表明叶片干燥处理后置于不同温度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）短期保存（3个月），其DNA质量也无明显差异。琼脂糖凝胶电泳结果进一步表明，硅胶干燥处理的叶片仍能提取出高质量的DNA，除槟榔的DNA略有降解外，椰子和油棕干燥处理的叶片提取的DNA与对照组无明显差异，表明叶片干燥处理后短期保存（3个月）于不同温度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）条件下，其DNA质量也无明显差异。通过SSR-PCR扩增检测，发现所有提取的DNA均能扩增出清晰一致的条带，进一步表明从硅胶干燥处理叶片中提取的DNA质量较好，能满足分子生物学试验的要求，这对远距离取样研究棕榈科植物居群遗传多样性是很有用的。

4 结论

从硅胶干燥处理的棕榈科植物叶片样品中提取的DNA质量较好，能满足分子生物学试验的要求;叶片干燥处理后短期保存（3个月）于不同温度（25 ℃，-20 ℃，-80 ℃）条件下，其DNA质量无明显差异;硅胶快速干燥叶片法能解决在棕榈科植物种质资源调查与收集时，不能及时将新鲜材料带回实验室而引起的褐化问题，同时干燥后的叶片长期保存不易变质，在DNA提取过程中也不易产生褐化。因此，硅胶干燥法是一种简便实用的理想方法。

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