天然有机物添加对金钗石斛快繁的影响

李晓君 潘继军 曹琦 普娅

摘要：为研究兰科植物组织培养常用有机添加物香蕉和马铃薯对金钗石斛快繁的影响，以云南临沧野生金钗石斛蒴果为材料，比较金钗石斛在添加不同类型或不同浓度添加物的种胚萌发培养基、原球茎分化培养基、幼苗扩繁培养基、生根培养基上的生长情况，结果表明，在MS培养基基础上添加马铃薯汁和香蕉汁均可促进金钗石斛种胚萌发和原球茎形成，最佳萌发培养基为MS+马铃薯汁30 mL/L+3%蔗糖;MS+马铃薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖适于金钗石斛原球茎分化成苗培养，在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁60～80 mL/L+3%蔗糖条件下幼苗的扩繁系数为4.8～5.1;MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L+3%蔗糖可用于金钗石斛生根培养。在金钗石斛组培快繁过程中，添加马铃薯汁可促进金钗石斛的种胚萌发、幼苗分化和扩繁，添加一定浓度的香蕉汁对金钗石斛生根具有较好的促进作用。

关键词：金钗石斛;香蕉汁;马铃薯汁;培养基

中图分类号： S567.23+9.043文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0079-04

收稿日期：2018-05-29

基金项目：滇西科技师范学院高层次人才科研启动项目（编号：LXJ2012）;云南省科技厅青年项目（编号：2017FD249）。

作者简介：李晓君（1985—），女，云南临沧人，博士，副教授，研究方向为植物生物技术与种质创新，E-mail：lxj-148@163.com。

金钗石斛（Dendrobium nobile）别称石斛，是主要的药用石斛之一[1]。金钗石斛的化学成分主要包括生物碱、倍半萜、联苄、芴酮、酚酸、苯丙素、菲、多糖等，具有抗肿瘤、降血糖、抗衰老、增强免疫力、促进胃液分泌、保护神经系统等作用[2-4]。金钗石斛花朵优美，具有较高的观赏价值。金钗石斛可采用扦插、分株、压条等方法进行繁殖，但由于生产效率较低，生产上金钗石斛的繁殖以组织培养（组培）为主，外植体材料可选择茎段，也可用蒴果，蒴果因消毒容易，幼苗生成量大，在生产上经常被采用[1，5-6]。研究表明，向培养基中添加天然有机物可促进组培石斛苗的生长，其中添加马铃薯汁和香蕉汁对金钗石斛的快繁具有促进作用，但各研究报道的添加方法和添加量不一[6-11]。本研究以MS为基本培养基，在金钗石斛组织培养的不同生长阶段添加不同浓度的香蕉汁或马铃薯汁，揭示香蕉汁或马铃薯汁添加浓度对金钗石斛各阶段组培苗生长的影响，找出合适的浓度添加范围，以期为金钗石斛种苗生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料及消毒方法

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）种植于滇西科技师范学院大棚[12]，于2016年4月对开花植株进行人工异花授粉，2016年11月收集蒴果进行培养。消毒方法：在超净工作台内，将金钗石斛蒴果用75%乙醇进行表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min，无菌水冲洗4次，将消毒后的果实置于灭菌的培养皿中，用解剖刀沿中心线纵切，用镊子夹住其中1/2，小心将种子均匀播撒于胚萌发培养基中。

1.2 相关试剂

香蕉汁：取黄熟香蕉，切成0.5 cm左右小丁，按照香蕉 ∶蒸馏水为1 g ∶1.5 mL的比例加蒸馏水煮沸后，小火煮至香蕉软烂，用纱布将上清滤出，用蒸馏水定容至浓度为1 g/mL，备用。马铃薯汁：取未长芽的马铃薯，切成细丝，按照马铃薯 ∶蒸馏水为1 g ∶1.5 mL的比例加蒸馏水煮沸后，小火煮至马铃薯软烂，用纱布将上清滤出，用蒸馏水定容至浓度为1 g/mL，备用。试剂：MS基本培养基相关药品为国产分析纯，6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）[13]和萘乙酸（NAA）由Sigma-Aldrich 公司提供。

1.3 金钗石斛各阶段培养基及培养条件

1.3.1 种胚萌发培养基

1-a：MS;1-b：MS+香蕉汁10 mL/L;1-c：MS+香蕉汁20 mL/L;1-d：MS+香蕉汁30 mL/L;1-e：MS+马铃薯汁10 mL/L;1-f：MS+马铃薯汁20 mL/L;1-g：MS+马铃薯汁30 mL/L。

该培养基添加蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH值调整至5.8，每个培养基接种5瓶以上，接种后置于光照培养箱中进行培养，周期性培养条件：光照培养温度为26 ℃，光照度为1 000 lx，培养时间为14 h;暗培养温度为24 ℃，培养时间为10 h，培养2个月后进行萌发情况以及原球茎质量比较分析。

1.3.2 原球茎分化培养基

2-a：MS;2-b：MS+馬铃薯汁20 mL/L;2-c：MS+马铃薯汁40 mL/L;2-d：MS+马铃薯汁60 mL/L。

该培养基添加蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH值调整至5.8，选择萌发情况最佳的原球茎，转入该培养基中，每种培养基接种5瓶以上，接种后于置于光照培养箱中进行培养，周期性培养条件：光培养温度为26 ℃，光照度2 000 lx，培养时间为14 h;暗培养温度为24 ℃，培养时间为10 h。培养2个月后进行幼苗生长情况比较。

1.3.3 幼苗扩繁培养基

3-a：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L;3-b：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁20 mL/L;3-c：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁40 mL/L;3-d：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁60 mL/L;3-e：MS+6-BA 1 mg/L+NAA0.2 mg/L+ 马铃薯汁80 mL/L;3-f：MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁100 mL/L。

该培养基添加蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH调整至为5.8，每种培养基接种5瓶以上，接种时标记每瓶接种苗数。培养条件同种胚萌发培养基，培养2个月后进行扩繁系数比较。扩繁系数统计：每个处理随机选取3瓶进行株数统计，扩繁系数=扩繁后瓶苗数/接种时苗数;株高测量：每个处理随机选3瓶，每瓶选取5株测量株高。

1.3.4 生根培养基

选取扩繁系数高、质量好的瓶苗作为培养材料，接入以下生根培养基中，每种培养基接种不少于5瓶，4-a：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L;4-b：MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁40 mL/L;4-c：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60 mL/L;4-d：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁80 mL/L;4-e：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁100 mL/L;4-f：MS+NAA1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁120 mL/L。

該培养基添加蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为7%，pH值调整至为5.8，培养条件：光培养温度为26 ℃，光照度为2 000 lx，培养时间为14 h;暗培养温度为24 ℃，培养时间为10 h。培养2个月后进行幼苗及根系生长情况比较。根量计数：每个处理选3瓶，每瓶随机测3丛苗根量;根长测量：每个处理选3瓶，每瓶随机测10根根长;株高测量：每个处理随机选3瓶，每瓶选取5株测量株高;丛苗数统计：每个处理随机选3瓶，每瓶随机选5丛苗计数。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS进行处理分析，采用LSD法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 香蕉或马铃薯汁及浓度对金钗石斛种胚萌发的影响

金钗石斛种胚播于种胚萌发培养基中培养2个月后，萌发情况见图1，萌发率及原球茎形态统计结果见表1。除了对照1-a外，种胚在各培养基的萌发率均达到20%以上，随着有机添加物浓度的升高，萌发效果变好，在添加马铃薯汁的培养基中萌发率均较添加同等浓度香蕉汁高，原球茎较为饱满，紧密，在添加香蕉汁的培养基中，原球茎顶部幼叶较为开展，原球茎间疏松易于分离，添加马铃薯汁的培养基中原球茎幼叶较为紧凑。结果说明，添加香蕉和马铃薯汁均对金钗石斛种胚萌发具有促进作用，在添加香蕉汁的培养基中，底部的种胚愈伤化成黄色，无法形成正常原球茎，可见添加马铃薯汁较有利于种胚萌发和早期原球茎的生长。生产上金钗石斛胚萌发培养基推荐使用MS+马铃薯汁30 mL/L+3%蔗糖。

2.2 马铃薯汁添加量对金钗石斛原球茎分化的影响

选取1-g处理的金钗石斛原球茎转入原球茎分化培养基中进行培养，培养2个月后，进行幼苗分化情况比较，结果见图2，在未添加马铃薯汁的MS培养基中，金钗石斛幼苗较黄，基部愈伤化明显，大部分原球茎分化不完全，未形成完整幼苗;在添加马铃薯汁的3个处理中，小苗分化较完整，基部无愈伤组织，原球茎分化率相近，小苗浓绿，相比2-b处理，2-c处理、2-d 处理的幼苗基部幼茎较粗壮，说明添加马铃薯汁对金钗石斛原球茎分化成幼苗具有促进作用，MS+马铃薯汁40～60 mL/L+3%蔗糖配方可用于金钗石斛原球茎分化成苗培养。

2.3 马铃薯汁添加量对金钗石斛扩繁的影响

选取处理2-d中的金钗石斛幼苗为材料，转入扩繁培养基中进行扩繁，培养2个月后，进行扩繁系数和幼苗生长情况统计，结果见表2，可以看出，添加马铃薯汁对金钗石斛增殖和生长均有促进作用，其中对扩繁系数的影响达到显著差异水平，马铃薯添加量达100 mL/L时，扩繁系数开始下降，添加量达80 mL/L时，苗高开始下降。在MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+马铃薯汁60～80 mL/L培养基中，扩繁系数达5.0左右，苗高为3.5 cm左右，可作为生产用幼苗扩繁培养基。

2.4 香蕉汁添加量对金钗石斛生根培养的影响

选取处理3-d中的幼苗进行生根培养，接种2个月后进行生根量、根长、株高和丛苗数统计，结果（表3）表明，在添加香蕉汁的各处理中金钗石斛的生根量、根长和丛苗数都与未添加香蕉汁的4-a处理呈显著差异，从整体趋势来看，在40～100 mL/L范围内，香蕉汁添加量与根量、根长呈正相关关系，当香蕉汁添加量达120 mL/L时，金钗石斛株高显著下降，香蕉提取物可溶性糖类丰富，株高下降可能与培养基渗透压过高有关。MS+NAA 1 mg/L+IBA 0.5 mg/L+香蕉汁60～100 mL/L培养基可用于金钗石斛生根培养，组培苗质量符合1级苗标准[5]。

图3为本研究所选用的材料及各阶段在最佳培养基中培养下的金钗石斛幼苗。

3 结论与讨论

蒋波等发现，在以茎段为材料诱导金钗石斛扩繁过程中，添加10%的椰子汁有利于金钗石斛原球茎增殖，而10%的香蕉汁则有利于原球茎分化[6]。唐德英等认为，在萌芽、增殖和成苗阶段均应选择马铃薯汁为添加物，浓度为200 g/L，在生根阶段应选用香蕉为添加物，添加量为150 g/L[7]。郑建铃研究发现，金钗石斛在分别添加70 g/L马铃薯泥和香蕉泥的1/2 MS培养基中萌发效果较好，其中添加70 g/L马铃薯泥的1/2 MS培养基对原球茎成苗效果较好，添加70 g/L香蕉泥的1/2 MS培养基对幼苗的生根效果较佳[8]。罗林会等在金钗石斛快繁体系的原球茎诱导增殖和分化阶段均添加2%的马铃薯汁，生根阶段添加2%浓度的马铃薯浆和香蕉汁，可以取得较好的效果[9]。徐德林等研究发现， 在金钗石斛种子萌发培养基中，添加10 g/L的马铃薯有利于种子萌发[10]。陈庭等在增殖培养基中添加20 g/L香蕉汁，取得了756.74%的类原球茎增殖质量率[11]。也有部分金钗石斛组织培养研究未添加任何天然有机物，而侧重于激素配比研究。如杨澜等在金钗石斛丛生芽诱导和增殖研究中，均未添加天然有机物[14-16]。目前尚未有专门针对金钗石斛组织培养中有机物及其添加量的研究报道，马铃薯和香蕉均为易于获取的天然有机添加物，其价格低廉，适用于生产。大部分研究添加马铃薯和香蕉时未过滤，直接做成泥进行添加，本研究发现，马铃薯泥和香蕉泥不溶部分在制备培养基时容易沉淀于培养基底部，在分装时常常造成不溶性物质分装不匀，进而造成试验误差，因此在试验方法中特别提出对二者的提取物进行过滤。本研究结合已有研究结果，在常规石斛及兰科组织培养激素配比基础上[17-18]，进行了马铃薯汁和香蕉汁添加和添加量的探讨，从种胚到生根培养，获得了较佳的有机物添加方案，可为后续金钗石斛大规模生产中的有机物添加提供参考。

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