超低温冷冻技术应用于鱼精子保存的研究进展

李景春 柯文杰 杨虹 于辉 杨映

摘要：介紹了超低温的发展历程、目前所取得的成果和优势所在，回顾了我国渔业生产中鱼精子的超低温的应用，及未来市场的发展前景。分析了该技术在应用过程中影响结果的因素，稀释剂、抗冻剂、冻融方法在操作过程中的原理原则和注意事项，以及目前解决超低温过程中产生问题所能采取的方法措施，总结了超低温目前存在的缺陷和未来需要发展的方向，有益于超低温冷冻在渔业领域大面积的推广及应用。

关键词：超低温冷冻;鱼精子;玻璃化;稀释液;抗冻剂;渔业

中图分类号： S961.2+2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0066-04

收稿日期：2019-06-21

基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项项目（编号：2018ZX08010-08B）;广东省动物分子设计与精准育种重点实验室[编号：（2019）75号]。

作者简介：李景春（1989—），男，广东湛江人，硕士研究生，主要从事鱼精子超低温冷冻方向的研究。E-mail：lijingchun1124@126.com。

通信作者：杨 映，博士，副教授，主要从事鱼精子超低温冷冻技术的研究。E-mail：4161341613@163.com。

随着科技高速发展，低温冷冻技术得到了大力发展，不再只是应用于食品，更是延伸到了生物学的各个研究方向，其中保种育种是一个方兴未艾的方向。在实际生产过程中，猪、牛、山羊等哺乳动物精子应用低温冷冻技术在养殖行业比较多，常见于各类新闻报道，而低温冷藏则存在着比较突出的弊端，即无法进行长期保存。随着鱼类养殖业的迅速发展以及杂交育种、优良品种的选育与提纯复壮等工作的开展，鱼类精液保存技术的应用越来越广泛。鱼类精液的保存方法有常温保存、冷藏保存和超低温冷冻保存。常温保存和冷藏保存用于短期保存精液，而超低温冷冻则用于长期保存精液[1]。自20世纪50年代英国学者 Blaxter利用干冰（-79 ℃）成功保存太平洋鲱鱼精巢，在复苏后仍能获得80%以上的受精率后[2]，鱼精子的超低温保存开始引起各国学者的关注。据统计，目前已有200多种鱼类精液得到了成功保存的先例。常见的有鲤鱼、四大家鱼、鳕鱼、虹鳟、鲑鱼、大马哈鱼、欧洲鳗、小体鲟、短吻鲟及花狼鱼等等[3]。大量研究表明，鱼类精液的超低温冷冻保存具有严格的种属特异性，目前很难找到一种统一通用的方法[4]。

从目前发展来看，超低温冷冻技术无论是在医学还是农牧渔业等领域，已表现出了显著的应用价值[5]，是未来渔业发展中人工授精的一个枢纽，主要体现以下几个方面优势：（1）大大节约资源成本。不再需要花费大量的物力、人力、财力来饲养大量的活体动物。（2）使用灵活便捷。不受时间空间限制，随时随地都能及时为科研或生产提供精子或胚胎，避免了雄雌性成熟不同步的顾虑，同时也解决了区域的远近距离问题。（3）降低生产风险。超低温冷冻技术能够最大限度地减少外界环境因素对实验动物种质资源的干扰，避免了动物源性疾病的传播。（4）能够进行长时间保存。避免考虑基因丢失、世代间隔、遗传漂变等活体保种所存在的各种各样问题。（5）通过冷冻配子能够扩大杂交范围，同时避免近交衰退。（6）建立重要物种资源库。为建立鱼类种质资源库开辟了一条新的途径[6]。本文则是在超低温冷冻的基础上对此技术进行分析和对未来进行展望，以期为鱼类种质资源保护和鱼类遗传育种的研究提供参考。

1 超低温冷冻技术概况

超低温冷冻技术是指超低温（-196 ℃）状态下，生物细胞的代谢活动几乎完全停止，生命活动处于静止状态，从而使其可以得到长期保存的一种技术[7]。超低温冷冻过程中，当冷冻温度继续下降，冷冻速度达到一定程度时，水分子表现为玻璃样的超微粒结晶核结实均匀的团块[8]。这是液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程，是一种可逆的转变，玻璃化冷冻是一种无晶形固化的物理现象，其本质是液体在快速超低温冷冻过程中，连续地固化形成无晶形、高度黏稠状态的玻璃体，玻璃化的主要特点是高浓度冷冻保护剂和瞬间降温（-130～-196 ℃，0～-60 ℃是冰晶形成的危险期），避免冰晶所造成的对细胞损伤和冻融效应。在超低温冷冻保存下，可以有效地将细胞内酶、蛋白质及其他细胞结构完好地保存下来，经最佳条件解冻复苏后，细胞仍然具有原来的代谢活性和功能性[9]。

2 超低温冷冻在鱼类精液保存中的应用

鱼的精子由头、颈、尾3个部分组成，头部含有线粒体，并为精子提供营养;尾部又称为鞭毛，是精子的运动器官。精子中主要含有钠、钾、钙、锌、镁等金属元素，其中钠和钾占总金属元素的99.7%～ 99.8%，起着稳定渗透压和抑制精子的作用[10]，整体来说，鱼的精子偏碱性，pH值在7.3～8.5区间，密度和浓度受季节的影响[11]。精子在精巢中处于静止状态，一旦排入水中，精子便被激活。由于精子的原生质极少，能量极其有限，当精子排入水中被激活后，寿命很短，因而可以利用降低精子代谢率的方法减少能量的消耗，以达到延长精子寿命的目的[12]。在鱼类的育种繁殖中，常常出现雌雄性成熟不同步现象，或者是雌雄鱼不同区域等问题，因此解决此问题的最佳途径是通过对精子的超低温冷冻，以达到随时随地都可进行供用的目的。

目前，鱼类精子的超低温冷冻，是在鱼的精子中按照一定比例加入稀释剂和抗冻剂，以达到精子内外渗透压的平衡，降低冰点，抑制精子的运动，使精子处于休眠状态而结构又没受到损伤，需要时解冻激活即可。常见的工艺流程为精液采集→镜检（活力>80%）→添加稀释剂和抗冻剂→降温平衡→液氮保存→解冻复苏→活力检测→授精。国外许多学者早在20世纪 70年代就对精子超低温保存进行过较详细的报道[13-14]。其中，整个流程，最为关键的是添加稀释剂、添加抗冻剂、降温平衡这3个步骤，可以说是直接导致冷冻成败的主要因素。由于不同种类鱼的精子生理特性具有很大差异性，目前没有通用的稀释剂和抗冻剂，每位学者在做试验中都是根据相关文献以及结合自己的经验对稀释剂和抗冻剂进行筛选的。冷冻方法常见的有以下4种：小丸颗粒冷冻法、安培瓶冷冻法、塑料离心管法、麦细管冷冻法。小丸颗粒冷冻法是将混合好的精液直接滴入液氮中保存，解冻时需要合适的解冻液;其他3种冷冻法的优势是避免了精液与液氮直接接触，但安培瓶由于体积较大，降温难以平衡，且操作复杂[15]。塑料离心管冷冻法容量大，操作简单，存放安全。麦细管冷冻法相对来说受温较快而又均匀，效果好，操作也简单。后面的这2种方法是目前主要使用的冷冻方法。无论是鲜精还是冻精，运动率都是评价精子质量的重要标准。按照精子运动活力状态，大概可以分为4个等级。A级：快速前向运动;B级：慢速或呆滞前向运动;C级：非前向运动;D级：极慢或不动[4]。在试验中，通常是选取活力大于80%精子进行超低温保存[16]，活力分析分传统的显微镜观察和现在主流的依靠计算机辅助分析（CASA）等，由于精子被激活后运动速度快和寿命时间短暂，传统的显微镜观察分析视野难以准确判断运动率。相对而言，计算机辅助分析就显得比较客观、精准、快速并且可以量化分析精子的生理特性，因此，根据目前所报道的文献来看，几乎是以后者为主[11]。在精子质量分析中，主要检测AB这2个级别精子动态，参数有以下这些：（1）运动的直线性（LIN）;（2）平均曲线运动速度（VCL）;（3）平均直线运动速度（VSL）;（4）平均路径运动速度（VAP）;（5）精子平均侧摆幅值（ALH）;（6）精子平均鞭打频率（BCF）;（7）精子平均移动角度（MAD）;（8）运动的摆动性（WOB）;（9）运动的前向性（SRT）;（10）检测所用时间（T）等等。

3 影响鱼精液超低温冷冻的因素

由于超低温冷冻步骤比较多，每个步骤在冷冻解冻操作过程中不同阶段损伤的累积会影响后续试验精子的死活。精液质量、稀释液的选择和比例的确定、pH值、渗透压、抗冻剂的选择和毒性、平衡条件、冻融方法以及授精条件等等都是水生动物精液低温保存能否成功的因素。其中影响最大的分别是低温保存剂和冻融方法，直接关系到试验中精子冷冻后复温能否存活。

3.1 稀释液的影响

鱼的精子排出体外后，由于环境变化、营养消耗，、能量代谢等原因，导致精子的存活时间缩短，从而死亡。因此，需要配制一种溶液来维持精子在体外的生理状态，稀释液一般没有毒性，对精子也没有激活效果。稀释液是第一个与精子直接接触的外来成分，是精子保存液的渗透压、pH值、代谢调节、能量来源的主要“阀门”[17]。稀释液的作用是使精子不受损害地以静止状态进入冻结状态，以延长精子的寿命。另外，稀释液还能稀释加进来的抗冷剂的浓度，降低抗冻剂对精子的毒害强度[18]。由于不同鱼类精子的特殊性，所以配制的稀释液也不同，到目前为止，仍然没有通用的稀释液[19]。常见的稀释液有盐类（如碳酸氢钠、氯化钠、碳酸氢钾、柠檬酸钠等）、糖类（如葡萄糖、蔗糖、果糖等）、脂类（主要是磷脂）和蛋白质（如卵黄、牛奶、小牛血清等）以及其他添加剂（如维生素、抗生素等）[11]。海水鱼用葡萄糖和柠檬酸钠组成的稀释液效果较好;淡水鱼类稀释液则以氯化钠和氯化钾为主，加入少量氯化钙、氯化镁、碳酸氢钠和葡萄糖[20]。同时，不同浓度的稀释液对精子有着很大的影响作用。顾正选等发现，使用0.5%浓度的NaCl溶液，齐口裂腹鱼的精子运动活力最好[21];魏开金等发现，使用0.5%浓度NaCl稀释液，鲥鱼的精子快速运动时间和寿命达到最长[22];李飞等认为，0.6%浓度的NaCl对胭脂鱼精子的运动时间和寿命都具有较佳的效果[23]。在稀释液中，pH值的差异也最为关键，不同pH值对不同鱼精子的寿命活力起到了不一的结果。大体上来说，鱼的精子是中性或者偏碱性，酸性环境容易破坏精子细胞结构，使精子失活。杨彩根等发现，黄颡鱼的精子在pH值7～9时活力最好[24]。孙翰昌等发现，禾花鱼精子在pH值为7时活力最强[25]。朱冬发等认为，适宜大黄鱼精子的pH值是7.5～8.0[26]。Na+、Ca2+、Mg2+ 、K+ 等离子既是鱼类精子的重要组成部分，同时也是构成渗透压的主要物质，对渗透压维持起到了重要作用[27]。不同离子在不同鱼类中所起的作用各有不同，K+在鲑科鱼类中起着抑制精子活力的作用，但在鲤科鱼类中却能提高精子运动速度、延长精子活力时间[28]。所以在配制稀释液时要根据对应的鱼类选择相对应的试剂，有利于提高精子冷冻的效果。在选择和配制稀释液时，尽量满足以下条件：（1）溶液的等渗性和各成分互不反应;（2）能为精子提供适宜的环境和适宜的pH值;（3）不能含有对精子有害的物质和含有抗菌物质[17];（4）在保证精子生存环境的前提下，其成分组成越简单越好[13]。

3.2 抗冻剂的影响

抗冻剂的选择决定了精子在冻存中的生死存亡，抗冻剂通常是低分子中性物质，原理是通过结合水分子，发生了水合作用，黏性增加，降低形成冰晶的结冰点，从而阻止冰晶对于精子造成不可逆变的机械损伤，从而达到抗冻的目的。常见得抗冻剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油（Gly）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、单糖、二糖等等，其中，这又分为可渗透和不可渗透2种。DMSO、酰胺类、乙醇类属于可渗透;单糖、二糖、多糖、聚合物等属于不可渗透。不同动物的种质细胞对加入抗冻剂的适应性和敏感性也不同[29]。王小刚等将10%～25%甲醇（MeOH）用于点带石斑鱼精子冷冻保存没有获得复活率[18]。而夏良萍等用10%甲醇（MeOH）对黄颡鱼精子冷冻保存有较好的保护效果[30];Chew等把乙二醇（EG）用于穗须原鲤精子超低温冻存试验时，发现效果不如甲醇（MeOH）好[31]。而程顺等发现，乙二醇（EG）在翘嘴鲌精子超低温冻存中取得最好的效果[32]。一般来说，抗冻剂对精子都存在着一定的毒性，当抗冻剂的浓度越大，毒性就越强，精子活力就越低[33]。这一观点已得到众多学者的认可。何斌等研究发现，甲醇（MeOH）、乙二醇（EG）、DMSO等抗冻剂随着浓度的增加会导致鱼精子的活力和运动时间相对应地下降[34]。闫秀明等研究发现，10%的DMSO对黄鳝精子的抗冻保护作用最好，毒性作用最弱[35]。王明华等认为，10%甲醇（MeOH）浓度对美洲鲥鱼精子保存效果最好，超过15%浓度会导致精子死亡[36]。同时平衡时间的长短和温度的高低与抗冻剂毒性也存在着一定的关联。在配制抗冻剂的过程中，几种抗冻剂的联合使用，有利于降低毒性，提高精子的活力[37]。同时渗透性和非渗透性抗冻剂混用有利于保持细胞膜的完整性，选择抗冻剂时优选选择低毒性抗冻剂，同时使用过程中尽量缩短抗冻剂和精子的接触时间，添加过程中可以考虑分步添加[38]，以免毒性过大直接导致精子死亡。抗冻剂对细胞的毒性主要发生在冻前和冻后处理的2个阶段，抗冻剂加入时一步添加和分步添加都是根据不同鱼种不同抗冻剂来选择的;复苏后将抗冻剂稀释或者洗脱，稀释和洗脱也有要求，如果添加或去除时操作不当，容易引起细胞损伤从而导致细胞死亡[11]。总的来说，选择或者配制抗冻剂时，要根据以下几个原则来执行：（1）抗冻剂对精子无毒或者尽量低毒;（2）抗冻剂对于精子不能有激活效果;（3）抗冻剂应具有营养性，增加精子的抗冷性能;（4）抗冷剂成分简单易配。

3.3 其他因素的影响

除了稀释剂和抗冻剂两大主要因素对精子的成活率造成影响外，冻融方法的影响紧跟其后，0～60 ℃是造成细胞不可逆转的机械损伤危险区[17]，适度降温，细胞越过了危险区则可以投入液氮中直接长期保存。Stoss等在-20～-30 ℃温度中保存银大麻哈鱼的受精卵复苏后没成活率，在-60～-100 ℃ 中保存泥鳅、草鱼的胚胎，获得10%～25%的胚胎复活率[14]。在冷冻过程中，降温和复苏都会造成细胞内水产生冰晶形成从而导致细胞损伤。因此，冷冻的步骤相对来说在整个超低温冷冻链中有着非同小可的位置。一般而言，降温分为3种形式：（1）慢速降温;（2）2步降溫;（3）3步降温[39]。众多文献资料显示，2步降温法和3步降温法在试验中比较常用。当降温后精子能够在液氮中长期保存后，复温的过程就显得极其重要，就算细胞以最佳的降温方式保存于液氮中，也有可能在复温过程中造成机械损伤而死亡。一般而言，降温速度快的话，复温的速度也需要相对应地加快，而在绝对值上，复温速度还是要比冷却速度快很多[40]，常用的复温方式是水浴，35～40 ℃的温水在1～2 min 内完成[41]。但也有学者通过室温就能解冻成功。林丹军等在室温（21～25 ℃）解冻大黄鱼精子取得不错的效果[42]。当复温成功后，抗冻剂的去除是一个不容忽视的问题，由于动物种质细胞没有细胞壁，所以无法像植物一样使用离心方法去除抗冻剂，相关学者都是通过添加溶液稀释抗冻剂的毒性，若稀释过程中溶液有着pH值、渗透压的影响，会导致解冻后细胞的死亡。抗冻剂去除后，激活液的选择也至关重要。由于鱼精子添加了抗冻剂和稀释剂，鲜精直接用水激活的方法已不适用解冻后的精子激活。陈松林等研究表明，由于DMSO的作用，冷冻过程中精子的渗透压会升高，若直接水激活，则导致内外渗透压过大，精子吸水后膨胀，活力大大下降[43]，所以一般选择配制溶液为激活液。

4 结论

目前来说，鱼精子的超低温保存已取得了很大的进步，可以应用于渔业生产，解决生产上一定范围内的难题。但是在相关文献报道中，几乎很少有学者报道精卵受精量比，如果用超过鲜精数量的冻精，10倍或数10倍的数量与一定数量的卵子配对，就算冻精活力很低，也能获得比较高的受精率。通过提高数量来掩盖冻存精子上存在的缺陷，相对来说是超低温冷冻上存在的不足，阻碍了技术的发展。另外许多鱼类的精子超低温冻存只是存在于试验摸索阶段，影响试验成果的因素很多，导致试验重复性差。大量的研究结果表明，经过冻存后的精子多少都受到了深浅不一的低温损伤（冰晶损伤、溶质损伤等），活力和受精率相对鲜精来说，还是略逊一筹。这是由于精子在温度下降的过程中耐不了低温而导致结构以及功能性破坏，另一方面是加入的抗冻剂的毒性影响了精子内外渗透压的平衡从而导致了精子的冻伤，每种抗冻剂的毒理药理导致精子死亡的机制至今没有多少学者进行深入探索和发现。同时，对于精子在超低温冷冻过程中造成的损伤本质所了解得还是不够深入透彻，还有待进一步研究探索。关于冷冻前是否需要平衡，不同学者观点不一样，有的学者认为，DMSO等抗冻剂渗透性比较强，能容易地渗透到精子内部，冻前不平衡比平衡效果好[44]，但丁淑燕等在试验过程中发现，平衡比不平衡效果好[45]。对于超低温冷冻后复温是否需要洗脱抗冻剂，目前也是没有统一的标准。复苏时水浴的温度和时间分别是多少最为合适，也是没有一个标准界限。鱼精子冻存解冻过程中受损必然导致受精能力衰退，如何发挥超低温冻存的优势，又缩小冻精和鲜精之间的差距，是学者们的共同研究方向[46]。就目前情况而言，精子的超低温冷冻在未来的发展中还是任重道远，有待进一步深入研究和探索。

参考文献：

[1]张崇英，李万文. 鱼类精液保存技术[J]. 海洋与渔业，2014（5）：69-70.

[2]Blaxter J H S. Sperm storage and cross-fertilization of spring and autumn spawning herring[J]. Nature，1953，172（4931）：1189-1190.

[3]邹仕成，李 万，周 亚. 水生动物精子低温保存研究进展[J]. 黑龙江畜牧兽医，2014（23）：201-203.

[4]周 磊，罗 渡，卢 薛，等. 斑鳜精液超低温冷冻保存及其效果分析[J]. 中国水产科学，2014，21（2）：250-259.

[5]邓普恩. 军曹鱼与红鳍笛鲷精液超低温保存及冷冻损伤研究[D]. 湛江：广东海洋大学，2011.

[6]李树梅，胡建武. 超低温冷冻保存实验动物资源研究进展[J]. 现代畜牧兽医，2017（5）：25-30.

[7]王华，杜立业，李 华. 微生物液氮超低温保存研究进展[J]. 食品与生物技术学报，2011，30（1）：1-5.

[8]David E P. Principles of cryopreservation[J]. Methods in Molecular Biology，2007，368（368）：39-57.

[9]Harding K，Benson E E，Julia M，et al. Cryopreservation of storage recalcitrant algae through fundamental studies of thermal behaviour and oxidative stress physiology[J]. Cryobiology，2006，53（3）：399-400.

[10]苏天凤，艾 红. 鱼类精子活力及其超低温保存研究综述[J]. 上海水产大学学报，2004，13（4）：343-347.

[11]郝 忱. 两种淡水经济鱼类精子超低温冷冻保存技术的研究[D]. 南京：南京农业大学，2009.

[12]于海涛，张秀梅，陈 超. 鱼类精液超低温冷冻保存的研究展望[J]. 海洋湖沼通报，2004（2）：66-72.

[13]Horton H F，Ott A G. Cryopreservation of fish spermatozoa and ova[J]. Journal of the Fisheries Board of Canada，1976，33（4）：995-1000.

[14]Stoss J，Holtz W. Cryopreservation of rainbow trout（Salmo gairdneri）sperm：Ⅳ. The effect of DMSO concentration and equilibration time on sperm survival，sucrose and KCl as extender components and the osmolality of the thawing solution[J]. Aquaculture，1983，32（3/4）：321-330.

[15]廖 馨，嚴维辉，唐建清，等. 淡水鱼类精子的冷冻与保存[J]. 生物学通报，2006，41（8）：16-17.

[16]舒德斌，刘雪清，张建明，等. 超低温冷冻保存中华鲟F1精子授精方法研究[J]. 水产科学，2018，37（4）：484-488.

[17]陈松林. 鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术[M]. 北京：中国农业出版社，2007.

[18]王小刚. 点带石斑鱼精子种质保存研究[D]. 海口：海南大学，2010.

[19]Irawan H，Vuthiphandchai V，Nimrat S. The effect of extenders，cryoprotectants and cryopreservation methods on common carp（Cyprinus carpio） sperm[J]. Animal Reproduction Science，2010，122（3/4）：0-243.

[20]陈 健，杨壮志，李良玉，等. 鱼类精液保存技术研究进展与前景展望[J]. 渔业致富指南，2018（8）：22-24.

[21]顾正选，丁诗华. pH值及不同百分浓度NaCl溶液对齐口裂腹鱼精子活力的影响[J]. 西南大学学报（自然科学版），2017，39（7）：72-76.

[22]魏开金，王汉平，林加敬，等. 氯化钠浓度对鲥鱼精子活力影响的初步观察[J]. 淡水渔业，1996（4）：9-10.

[23]李 飞，万 全. 环境因子对胭脂鱼精子活力影响的研究[J]. 淡水渔业，2009，39（4）：22-28.

[24]杨彩根，宋学宏，王永玲. pH值及不同浓度NaCl溶液對黄颡鱼精子活力的影响[J]. 水利渔业，2003，23（3）：10-11.

[25]孙翰昌，李云瑶，吴清毅. 不同浓度NaCl溶液及pH值对禾花鱼精子活力的影响[J]. 黑龙江畜牧兽医，2012（3）：140-142.

[26]朱冬发，成永旭，王春琳，等. 环境因子对大黄鱼精子活力的影响[J]. 水产科学，2005（12）：4-6.

[27]苏德学，严安生，田永胜，等. 阳离子，葡萄糖及渗透压对丁精子活力的影响[J]. 水利渔业，2004，24（1）：7-8.

[28]Morisawa M，Suzuki K. Osmolality and Potassium ion：their roles in initiation of sperm motility in teleosts[J]. Science，1980，210（4474）：1145-1147.

[29]郝 忱，严维辉，丁淑燕，等. 鱼类精子超低温冷冻保存技术及其应用[J]. 水产养殖，2014，35（7）：48-52.

[30]夏良萍，陈梦婷，陈悦萍，等. 黄颡鱼精子超低温冷冻保存技术[J]. 江苏农业科学，2013，41（10）：196-198.

[31]Chew P C，Hassan R，Rashid Z A，et al. The current status of sperm cryopreservation of the endangered Probarbus jullieni（Sauvage）in Malaysia[J]. Journal of Applied Ichthyology，2010，26（5）：797-805.

[32]程 顺，顾志敏，刘士力，等. 翘嘴鲌精子生理特性及超低温冷冻的研究[J]. 江苏农业科学，2019，47（7）：175-179.

[33]荆荣燕. 斑马鱼（Danio rerio）精子的超低温冷冻保存[D]. 汕头：汕头大学，2007.

[34]何 斌，陈彦伶，龙治海，等. 几种抗冻剂对达氏鲟精子活力及运动时间的影响[J]. 西南农业学报，2017，30（4）：962-968.

[35]闫秀明，张林达，张小雪. 黄鳝精液-80 ℃超低温冷冻保存试验[J]. 四川动物，2011，30（2）：207-211.

[36]王明华，陈友明，丁淑燕，等. 美洲鲥鱼精子超低温冷冻保存技术初探[J]. 江苏农业科学，2015，43（7）：250-251.

[37]Wu Z，Zheng X，Luo Y，et al. Cryopreservation of stallion spermatozoa using different cryoprotectants and combinations of cryoprotectants[J]. Animal reproduction science，2015，163：75-81.

[38]陈松林，章龙珍，郭 锋. 抗冻剂二甲亚砜对家鱼精子生理特性影响的初步研究[J]. 淡水渔业，1987（5）：17-20.

[39]Chen S L，Ji X S，Yu G C，et al. Cryopreservation of sperm from turbot （Scophthalmus maximus） and application to large-scale fertilization[J]. Aquaculture，2004，236（1/2/3/4）：547-556.

[40]李广武，郑从义，唐 兵. 低温生物学[M]. 长沙：湖南科学技术出版社，1998.

[41]丁淑燕，严维辉，郝 忱，等. 兴国红鲤精液超低温冷冻保存及效果分析[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：277-279.

[42]林丹军，尤永隆. 大黄鱼精子生理特性及其冷冻保存[J]. 热带海洋学报，2002（4）：69-75.

[43]陈松林，刘宪亭，鲁大椿，等. 鲢、鲤、团头鲂和草鱼精液冷冻保存的研究[J]. 动物学报，1992，38（4）：413-424.

[44]Fauvel C，Suquet M，Dreanno C，et al. Cryopreservation of sea bass （Dicentrarchus labrax） spermatozoa in experimental and production simulating conditions[J]. Aquatic Living Resources，1998，11（6）：387-394.

[45]丁淑燕，李跃华，黄亚红，等. 刀鲚精子超低温冷冻保存技术的研究[J]. 水产养殖，2015，36（1）：32-34.

[46]周 洲，孔 杰，赵 凤，等. 鱼类精子超低温冷冻保存技术研究进展[J]. 贵州农业科学，2019，47（3）：89-92.