4种长链非编码RNA在重度冠心病患者外周血单个核细胞中的表达及临床意义

游赣花， 龙向淑， 宋方， 黄晶， 田茂波， 肖燕， 邓世燕， 吴强**

(1.贵州大学医学院， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省食品药品检验所, 贵州 贵阳 550004； 3.贵州省人民医院 心内科， 贵州 贵阳 550002； 4.贵州大学人民医院 心内科， 贵州 贵阳 550002)

冠心病(coronary heart disease, CHD)是严重威胁人类健康的重要疾病之一，研究表明，年龄>55岁的CHD患者生存风险高达67%[1]。因此，CHD新诊疗靶点的寻找及治疗方案的优化极其重要。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类转录物长度大于200 nt 、且不具有蛋白编码功能的非编码RNA[2-3]，可参与调控多种心血管疾病，如心力衰竭、心肌肥大、心脏梗死和动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的发生发展[4-5]。研究表明lncRNA能从体液中稳定地检测到，并有可能作为CHD非介入诊断的新型生物标志物[6]。因此，本文拟研究重度CHD患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)、核糖核酸牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated 1,TUG1)、Ezrin反义RNA1(ezrin antisense RNA,EZR-AS1)、lncRNA n342419(MANTIS)的表达，分析其在重度CHD中的临床意义，为重度CHD诊断及治疗靶点的寻找提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1一般资料 选取2018年6月-8月经冠状动脉造影确诊CHD、且至少1支主要冠状动脉血管狭窄>80%的稳定型心绞痛患者(即重度CHD者)作为CHD组，排除标准：(1)不稳定型心绞痛或心肌梗死，(2)合并其他器质性心脏病，(3)合并严重肝肾功能障碍、家族性高胆固醇血症、恶性肿瘤、炎症性疾病、自身免疫性疾病、活动性肺结核及严重精神疾病患者。CHD组共纳入患者35例，男24例、女11例，年龄50～75岁、平均(64.59±8.84)岁。选取同期无CHD的体检人群38例为对照组，男22例、女16例，年龄50～75岁、平均(57.33±6.12)岁。

1.1.2主要试剂和仪器 逆转录试剂盒及SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒购自日本TAKARA公司，血液总RNA快速提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司，PCR扩增引物由上海生工生物工程有限公司合成；AU680全自动生化分析仪购自美国Beckman Coulter公司， P05775 PCR仪购自美国Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1标本采集 收集所有研究对象的临床资料，包括性别、年龄、吸烟、饮酒、高血压、Ⅱ型糖尿病情况等；采集重度CHD患者住院第2天和对照组体检人群体检当天的空腹静脉血8 mL，其中5 mL采用全自动生化分析仪测定总胆固醇(cholesterol ，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)、 低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)等指标，3 mL用于RNA提取。

1.2.2实时定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA表达 按试剂盒说明书提取PBMC中RNA，逆转录成cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTM进行qRT-PCR扩增。PCR扩增条件为：95 ℃、1 min预变性，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，重复循环40次；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，进行熔解曲线分析。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算所有研究对象MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在 PBMC中的相对表达量。引物序列见表1。

表1 实验所用PCR引物序列及扩增片段大小Tab.1 PCR primer sequences

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 临床特征

CHD组患者HDL-C水平较对照组体检人群明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，但2组研究对象间年龄、吸烟、饮酒、高血压、Ⅱ型糖尿病、CHOL、HDL-C、LDL-C等指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 CHD组患者与对照组体检者的临床特征比较Tab.2 Comparison of clinical characteristics between two groups

2.2 lncRNA表达

qRT-PCR检测结果表明，CHD组患者MALAT1、TUG1、EZR-AS1的表达水平比对照组体检者明显升高，但MANTIS的表达则明显降低，差异均有高度统计学意义(P<0.01)。见图1。

注：(1)与对照组比较，P<0.01。图1 lncRNA MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在对照组和CHD患者PBMC中的表达Fig.1 Expression of lncRNA MALAT1, TUG1, EZR-AS1, and MANTIS in control group and CHD group

2.3 ROC曲线

MALAT1的AUC为0.851，标准误为0.045，95%CI为0.764～0.938(P<0.01)，灵敏度和特异度分别为80%和78.95%；TUG1的AUC为0.768，标准误为0.054，95%CI为0.662～0.875(P<0.01)，灵敏度和特异度分别为100%和52.63%；EZR-AS1的AUC为0.884，标准误为0.037，95%CI为0.811～0.957(P<0.01)，灵敏度和特异度分别为82.86%和78.95%；MANTIS的AUC为0.807，标准误为0.051，95%CI为0.707～0.907(P<0.01)，灵敏度和特异度分别为94.29%和60.53%。见图2。

注：A为MALAT1，B为TUG1，C为EZR-AS，D为MANTIS。图2 lncRNA MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS诊断CHD的ROC 曲线Fig.2 ROC curve of lncRNA MALAT1, TUG1, EZR-AS1, and MANTIS

3 讨论

CHD是冠状动脉粥样硬化引起心肌缺血缺氧而导致的心脏病，AS是CHD的重要病理生理基础[7]。随着转录组测序以及生物信息学技术的发展和应用，lncRNA在个体发育和疾病发生过程中的重要作用引起了关注[8]。2012年，美国食品药品监督管理局授权lncRNA前列腺癌抗原3(第一个应用于临床的非编码RNA)用于前列腺癌临床诊断。靶向lncRNA不仅适用于肿瘤，同样适用于心血管疾病[9]。研究显示，lncRNA可通过抑制人主动脉平滑肌细胞的增殖、迁移以及调节层流剪切力等机制，发挥抗AS作用[10-11]。因此，定义lncRNA的功能可能有助于识别CHD的新的诊断和治疗靶点。

MALAT1转录本在人类中长约7 kb，位于人类染色体11q13位置上，是在多种癌症中过度表达的lncRNA，其高表达与肿瘤生长、转移相关[12-13]。同时，有研究发现MALAT1与AS亦密切相关，用ox-LDL处理的内皮细胞缺失外泌体MALAT1时可促进AS的形成，而敲低MALAT1表达对小鼠AS进展起抑制作用[14-15]。一般情况下，1支或1支以上主要冠状动脉狭窄程度达到50%即可诊断为CHD[16]。本研究选用冠脉狭窄>80%的患者血液，拟筛选出与CHD严重程度相关的lncRNA。结果表明，MALAT1在CHD患者PBMC中高表达(P<0.01)，AUC为0.851，95%CI为0.764～0.938，灵敏度和特异度分别为80%、78.95%，表明MALAT1对重度CHD的诊断具有较高的灵敏度和特异度。

TUG1转录本长7.1 kb，位于人类染色体22q12.2位置上，最初在牛磺酸处理的小鼠视网膜细胞中发现[17]。研究发现TUG1与AS的发生相关，如TUG1可通过上调miR-26a的表达来抑制apoE-/-小鼠AS损伤的形成[18]；TUG1在主动脉瓣钙化过程中可通过上调runx2促进成骨细胞分化[19]。本研究发现，TUG1在CHD患者PBMC中高表达(P<0.01)，AUC为0.768，95%CI为0.662～0.875，灵敏度和特异度分别为100%、52.63%，由此可知，TUG1诊断重度CHD具有较高的灵敏度，但特异度较低，这可能与高血压、心肌纤维化等心血管疾病都会引起TUG1表达异常有关[20-21]。

EZR-AS1是一个新型的lncRNA，最初被发现在人食管癌组织中高表达，并可通过上调EZR表达促进癌细胞迁移[22]。本研究发现EZR-AS1在CHD患者PBMC中高表达(P<0.01)，AUC为0.884，95%CI为0.811～0.957，灵敏度和特异度分别为82.86%、78.95%，提示EZR-AS1对重度CHD的诊断具有较高的灵敏度和特异度。

MANTIS是一种具有促进内皮血管生成功能的新型lncRNA，研究表明MANTIS参与了层流及他汀类药物诱导的信号转导并发挥内皮保护作用，同时层流及他汀类药物均可增加MANTIS的表达，提示MANTIS具有抗AS作用[23-24]。本实验结果显示MANTIS在CHD患者PBMC中低表达(P<0.01)，AUC为0.807，95%CI为0.707～0.907，灵敏度和特异度分别为94.29%、60.53%，由此可知，TUG1诊断重度CHD具有较高的灵敏度，但特异度不高，可能与其他心血管疾病会引起MANTIS表达异常有关，具体原因有待进一步探索。

综上所述，本研究结果提示MALAT1、TUG1、EZR-AS1、MANTIS在重度CHD患者PBMC中差异性表达，与CHD严重程度相关，具有成为CHD诊断及病情评估生物标志物的潜能。