我国主产地温石棉可吸入纤维致鼠肺损伤与抑癌基因p53、p16的表达

2019-11-28曾娅莉邹文蓉董发勤张青碧邓建军

岩石矿物学杂志 2019年6期

曾娅莉，崔琰，邹文蓉，马骥，董发勤，张青碧，邓建军，杨洁，高 ●

(1. 四川绵阳四○四医院，四川绵阳 621000； 2. 西南医科大学，四川泸州 646000； 3. 西南科技大学，四川绵阳 621000)

吸入性粉尘可引起呼吸、心血管、血液系统甚至病毒传播等疾病(Guanetal.， 2016； Wangetal.， 2016； Yeetal.， 2016； Gaoetal.， 2017)，危害人体健康。我国是温石棉生产和使用大国，人们在生产和使用过程中产生大量吸入性纤维粉尘，污染环境。国际上对温石棉的安全性一直存在较大争议，长期吸入这些粉尘是否致肺损伤或肺癌性未知。国外研究资料(Bernsteinetal.， 2013； Gaoetal.， 2015; Bauretal.， 2015； Gilhametal.， 2016)显示，温石棉具有致间皮瘤或者肺癌的风险。国内关于可吸入性温石棉纤维粉尘的安全性研究较少，杜利利等(2014)的流行病学调查显示长期接触温石棉的矿工，其肺癌、石棉肺、肺心病、呼吸系统疾病的死亡率明显提高。近年来本课题组一直从事温石棉粉尘职业病和安全性的基础性研究。曾娅莉等(2013)通过细胞培养技术、体外分析比较了四川新康及陕西陕南温石棉的安全性，结果显示两种温石棉对细胞生长具有较强抑制作用，显著下调p16和p53蛋白，有诱导癌症发展的风险。柏●等(2017)采用多次非暴露式气管滴注的染毒法研究了四川新康温石棉纤维粉尘对雄性Wistar大鼠肺组织的危害，检测了各项生化指标，结果显示四川新康温石棉纤维粉尘可致大鼠肺损伤。王玉琳等(2018)研究发现温石棉可通过ROS途径激活线粒体凋亡通路，诱导A549细胞发生凋亡。黄凤德等(2018)分析了四大矿区温石棉的物相成分、谱学特征等，研究比较了四大矿区温石棉对A549细胞的生长抑制和细胞周期的影响，实验结果显示四大矿区温石棉的主要物相是斜纤蛇纹石，但不同产地的温石棉结构表面完善性、化学基团存在差异，4种温石棉纤维粉尘均于G2/M期阻滞A549细胞。由于青海茫崖、甘肃阿克塞、陕西陕南和四川新康矿区是我国温石棉主要产地，目前尚缺乏对4种主产地的温石棉纤维粉尘在生物体内对呼吸系统损伤和致癌风险的比较和评估。课题组在前期研究的基础上，选取由我国四大矿区温石棉制备成的可吸入纤维粉尘，研究比较了可吸入温石棉粉尘对Wistar大鼠肺组织的有无损伤及损程度，同时检测了大鼠的抑癌基因p53、p16，评估其有无致癌风险，从体内和分子水平探讨了我国四大矿区可吸入性温石棉的生物安全性，欲为环境检测和职业病防护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验对象

实验对象为体重180～200 g的Wistar雄性大鼠，购买自华西医科大学SP级实验动物中心。四大矿区温石棉分别采自青海省茫崖矿区、甘肃省阿克塞矿区、陕西省陕南矿区和四川省新康矿区。

1.1.2 试剂和仪器

试剂有HE试剂(武汉博士德生物工程有限公司)、Triol试剂提取盒(北京TIANGEN BIOTECH CO，LTD)、Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser和PCR试剂(大连Takara公司)，引物由Takara公司设计。

仪器有高速多功能粉碎机(RH-800，浙江荣浩工贸有限公司)、卧式行星球磨机(QM-3SP4J，南京大学仪器厂)、激光粒度分析仪(90 plus，美国Brookhaven公司)、红外光谱仪(Spectrum One，美国PE公司)、RT-PCR扩增仪(Mastercycler X50h，德国Eppendorf公司)、DNA/RNA测定仪(ND-1000，美国Nano Drop)、凝胶电泳成像系统(GelDocXR，美国BIO-RAD公司)、凝胶电泳扫描仪(GE Image scanner III，美国GE Healthcare公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 可吸入温石棉纤维粉尘的制备

4种产地的可吸入温石棉纤维由高速粉碎机初步粉碎至 60目，按照粒料液(无水乙醇)比1∶1，用球磨机湿磨，检测纤维粒径。当纤维粒径约为5 μm时收集矿浆，120 ℃烘干，再次磨碎，400目过筛，高压灭菌，加生理盐水配置成8 mg/mL储存液，备用。

1.2.2 粉尘染毒Wistar雄性大鼠造模

将8～10 周龄健康未成年Wistar雄性大鼠54只，随机分为3组即2 mg/mL染毒组、阴性和阳性对照组，每组18只，分笼喂养，适应性喂养1 周。将4种温石棉储备液分别稀释为2.0 mg/mL应用液，加入青霉素钠8 000 U/mL，超声处理30 min，采用非暴露式气管滴注法染毒Wistar雄性大鼠，每次滴注0.5 mL，间隔1个月滴注1次。阳性对照组将苯并芘溶于玉米油配成40 mg/mL染毒液，阴性对照组使用生理盐水，每次滴注0.1 mL。滴注后大鼠自由饮水、进食，观察其生长、发育及活动等一般情况。

1.2.3 纤维粒径、物相和化学成分特征

采用90 plus激光粒度分析仪检测各组温石棉纤维粒径，采用Spectrum One傅里叶变换红外光谱仪分析研磨后的粉尘结构和表面化学基团。

1.2.4 肺组织脏器系数和病理检测

分别于染毒1、3及6 个月时称重后处死Wistar大鼠，迅速分离肺组织并称量，置-80℃冰箱保存备用。Wistar大鼠的肺组织脏器系数=肺组织(g)/体重(g)。肉眼观察处死Wistar大鼠的肺组织外观，选取主支气管周围肺组织，生理盐水反复冲洗。置10%福尔马林溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察肺组织的病理变化。

1.2.5 染毒Wistar大鼠肺p53和p16基因检测

将处死Wistar大鼠的肺组织，按Triol试剂盒说明书提取总RNA，DNA/RNA测定仪检测RNA的浓度和纯度，调整RNA浓度一致，按照聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)试剂说明书进行PCR扩增。引物设计： p53引物，104pb，正向5’→3’： AGGAAATCCGTATGCTGAGTATCTG，反向5’→3’： GGATAGTGGTATAGTCGGAGCCG)； p16引物， 97pb，正向5’→3’CTAGAGCGGGGACATCACGA，反向5’→3’： AGCAGAAGTTATGCCTGTCGGT)。扩增条件：94℃变性2 min，94℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃20 s，循环35次，72℃终末延伸3 min。琼脂糖凝胶电泳PCR产物，凝胶电泳成像系统对电泳条带照相和灰度值的扫描，以β-actin为内参对照。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 纤维粉尘粒径分布

4种温石棉纤维通过卧式行星球磨机湿磨20 h，收集样本。采用90 plus激光粒度分析仪测定粒径，结果见表1。从纤维粒度分布数据来看各纤维的平均粒径均小于或接近5 μm，符合可吸入粉尘粒径要求。

表 1 湿磨法20 h的四大矿区温石棉纤维粒度分布 μmTable 1 Particle size distribution of chrysotile fibers in four main mining areas with 20 h wet grinding

注：d10对应的粒径数据表示小于此粒径的颗粒体积分数占全部颗粒的10%,d25、d50、d75以此类推。

2.2 研磨前后粉尘的结构和官能基团分析

Salamatipour等(2016)研究显示，研磨石棉的方法不同可显著影响粉尘表面含铁量，铁可诱导细胞产生的活性氧，从而形成细胞毒性差异，并建议在研究石棉纤维的细胞毒性时应详细描述粉尘制备方式。本研究中采用湿磨法，为了使研磨后的各样品粒径小于10 μm，又防止过度研磨破坏纤维表面结构从而干扰实验结果，通过红外光谱分析了研磨后各纤维粉尘组化学基团，以分析研磨后的粉尘是否有理化性质改变。

Enrico等(2009)研究发现，温石棉的结晶度和OH-含量与其在动物体内的溶解性、降解及细胞毒性相关。由图1可见，经过研磨后的4种温石棉样品的FT-IR图谱的吸收峰的峰位峰形基本不变。比较4种图谱，发现茫崖、陕南温石棉在(1 622、1 618 cm-1)附近的吸收谱带向高波数偏移，新康温石棉在(1 630、1 455 cm-1)附近的吸收谱带发生了偏移。这是由于红外光谱对阳离子质量和电价比较敏感，OH-伸缩振动频率受到与OH-配位的八面体阳离子的影响产生分裂并向低波数方向位移。阿克塞和陕南温石棉在1 060 cm-1附近的Si—O伸缩振动峰吸收带分裂比茫崖和新康石棉明显，表明这两种温石棉的表面结构较茫崖和新康温石棉的完善。通过上述分析，可初步确定4种温石棉样品为纤蛇纹石，研磨后的温石棉粉尘结晶度和化学基团未发生明显变化。

2.3 肺组织外观

4种温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠1～6个月，肺组织病变基本相似，肺损伤程度与染毒时间呈正比，4种产地的温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺组织病变程度不同。与对照组相比，染毒1个月，Wistar大鼠肺组织体积变大，气管周围充血明显，表面可见少量白色瘤状突起，凹凸不平。染毒3个月，Wistar大鼠肺外观充血明显，体积比染毒1个月时缩小，肺组织塌陷，皱缩，肺表面的白色瘤状增多。染毒6个月，Wistar大鼠肺体积进一步缩小，组织实变，弹性变差，充血明显，肺组织表面凹凸不平加重，4种温石棉染毒后肺组织均未发现肉眼可见瘤变。图2显示的是茫崖温石棉染毒Wistar大鼠组肺外观，其余各染毒组肺组织外观相似。

2.4 肺组织脏器系数

与阴性对照组比较，染毒1 个月，4组温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺系数变化无显著差异。染毒3个月，新康、茫崖和陕南温石棉纤维粉尘染毒的Wistar大鼠体重明显减轻，肺重量显著增加，肺系数变大，变化具有显著意义(P<0.05)。染毒6个月，4组温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺系数增大，变化具有显著意义(P<0.05)，如表2所示。染毒6个月，4组可吸入温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺组织脏器系数由大到小的顺序均为：新康>茫崖>阿克塞>陕南。

图 1 我国四大矿区温石棉研磨后的FT-IR图Fig.1 FT-IR diagrams of chrysotile grinding 20 h in four main mining areas of China

图 2 茫崖温石棉染毒1、3、6个月Wistar大鼠肺组织外观图Fig.2 1, 3 and 6 months lung histomorphology of Wistar rats exposed to 2.0 mg/mL chrysotile asbestos in Mangya

表 2 我国四大矿区温石棉染毒1、3、6个月Wistar大鼠肺组织肺系数Table 2 Lung organ visceral coefficient of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

a表示与对照组比较有显著差异(P<0.05)。

2.5 肺组织病理切片(HE染色)

4组温石棉染毒Wistar大鼠肺组织均发生显著的病理改变，出现不同程度的充血、水肿、炎性细胞和巨噬细胞浸润，肺间隔增宽，平滑肌破坏，肺泡大小不均和数量减少。随着粉尘作用时间延长，各染毒组Wistar大鼠肺病变逐渐加重，出现严重肺实变、纤维化，肺泡细胞大量破裂，肺组织塌陷。不同产地温石棉致病变的方式不同，阿克塞温石棉组的Wistar大鼠肺以出血和炎症细胞浸润为主，茫崖温石棉组的Wistar大鼠肺以炎症细胞浸润为主，肺泡轻度改变；陕南和新康温石棉组染毒的Wistar大鼠肺以肺间隔增宽、支气管周围炎性细胞浸润病变为主(图3)。

2.6 肺组织p53、p16基因检测

与阴性对照组相比，染毒1个月时各组p53基因表达无显著性降低；染毒3个月时，除四川新康外各染毒组p53基因均降低，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)；染毒6个月时各组p53基因进一步降低表达降低，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。p53基因降低趋势由大到小为：阿克塞>陕南>茫崖>新康(图4)。

与阴性对照组相比，染毒1个月时除阿克塞温石棉组外，其余各组p16基因表达均显著性降低，染毒3～6个月各组p16基因表达进一步降低，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。p16基因表达降低趋势由大到小为：新康>茫崖>阿克塞>陕南(图5)。

图 3 四大温石棉矿区可吸入纤维粉尘染毒Wistar 大鼠的肺组织HE切片图Fig.3 HE section of lung tissue of Wistar rats exposed to inhalable fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four main chrysotile asbestos mining areas

3 讨论

3.1 温石棉可改变肺组织外观及肺脏系数

由不同染毒时间Wistar肺组织外观可见，我国四大产地可吸入温石棉纤维粉尘均不同程度损害肺组织，使肺组织产生炎性或纤维化改变，但未见瘤样组织。脏器系数是毒理实验中常用指标，动物染毒后，受损脏器重量可发生改变，脏器系数也随之改变。脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等病变；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。与对照组比较，温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠1个月，肺脏系数无显著性变化，染毒3～6个月，Wistar大鼠体重逐渐降低，肺组织重量逐渐增加，肺脏系数随之增大，与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。肺脏器系数和肺组织外观结果显示我国四大产地的温石棉可吸入纤维粉尘可损害肺组织，使肺组织充血、水肿或肥大增生，随之实变，损伤程度和病变方式随产地不同。Kim等(2015)研究发现暴露于高浓度石棉环境中矿工体内的肺石棉斑和肺纤维化显著高于正常人，CT结果显示胸膜石棉斑块数量和大小不同。Lemaire等(1986)研究发现石棉肺病变特点是巨噬细胞积累，成纤维细胞增殖和胶原沉积。这些研究显示温石棉的可吸入纤维粉尘可致肺组织损伤，长期吸入可使肺组织纤维化，与本研究结果一致。

图 4 我国四大矿区温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺组织的p53基因表达Fig. 4 p53 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

图 5 我国四大矿区温石棉纤维粉尘染毒Wistar大鼠肺组织的p16基因表达Fig. 5 p16 gene expression in lung tissue of Wistar rats exposed to chrysotile asbestos fiber dust at the time in 1, 3, 6 months in four major mining areas of China

3.2 温石棉可致肺组织病理改变

HE染色结果显示，4种温石棉可吸入纤维粉尘可不同程度和方式损伤肺组织结构，长期染毒均可使肺组织纤维化(图2、图3)。FT-IR分析结果显示，温石棉主要成分、化学基团与表面结构的完善性与产地之间存在差异(图1)，这可能与4种产地温石棉对生物安全性不同相关。温石棉主要结构为由硅氧(SiO2)四面体和Mg(OH)2八面体组成的具双层型结构的三八面体硅酸盐矿物，不同产地温石棉的SiO2和杂质含量不同。Piao等(2001)研究显示暴露于SiO2颗粒可致大鼠肺组织损伤，早期主要表现为炎症，后期为肺间质纤维化。4种不同产地温石棉可吸入纤维粉尘对Wistar大鼠肺组织损伤程度与方式可能与SiO2和杂质含量相关。

关于温石棉的细胞毒性和机制国内有少量研究。查雨欣等(2017)研究发现，新康和茫崖温石棉可致大鼠体内产生过量ROS，导致脂质过氧化作用，抗氧化酶SOD耗竭或失代偿，清除自由基的能力下降，造成大鼠肺氧化应激损伤，不同地域温石棉氧化损伤作用存在差异。黄凤德等(2018)研究显示我国4大主产地的温石棉均不同程度地抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期，推测温石棉诱导细胞与凋亡大小与不同产地的化合物杂质含量不同相关。曾娅莉等(2012)研究显示温石棉纤维对V79细胞具有细胞毒性，其毒性大小与温石棉在有机酸中的溶蚀性相关。何静等(2014)研究发现不同矿床的温石棉，因生成条件不尽相同，表现活性基团不同，则对细胞的毒性不同,这些研究与本实验结果相似，具体原因还需进一步研究。

3.3 温石棉降低肺p53、p16基因表达

p53基因具有抑制细胞分裂、修复损伤的DNA以及诱导细胞凋亡等功能。p53基因时刻监控着细胞染色体DNA的完整性，参与DNA的复制与修复，如果修复失败，p53蛋白即启动凋亡，诱导细胞自杀，从而防止细胞恶变。p16基因是参与细胞周期调控的基本基因，可调节细胞的增殖及分裂。目前研究资料认为p16是比p53更为重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。p53、p16基因是细胞周期重要的调控因子和抑癌基因，它可修复受损的DNA，避免细胞癌变，与肺癌的发病密切相关(Demirhanetal.， 2010； Stankovicetal.， 2014； Yangetal.， 2017)。它们的降低，意味着个体容易发生癌变，检测p53和p16基因对肿瘤的诊断具有十分重要的意义。

本实验检测到我国四大产地的温石棉可吸入纤维染毒Wistar大鼠后均降低抑癌基因p16和p53表达，但不同产地的温石棉纤维粉尘对p53与p16降低的程度不同。 Mishra 等(1997)研究显示老鼠暴露于温石棉纤维的气溶胶24 h，免疫组化法检测到p53蛋白升高，8 d开始下降，14 d后低于正常水平。曾娅莉等(2013)研究显示我国四大产地的温石棉均不同程度抑制V79细胞生长，下调p16和p53，有诱导癌症发展的风险。叶微等(2015)研究显示4种温石棉的单细胞凝胶电泳实验和V79细胞微核实验可致细胞染色体和DNA的不稳定性，这些研究与本实验结果类似。至于温石棉致肿瘤的风险评估，还需进一步证实。