RANKL/RANK/OPG信号通路参与调控磷酸三钙磨损颗粒诱导假体周围骨溶解的研究

贺志强，杨亚帆，陈先州，刘乃澄，余勤武*

(1.仙桃市第一人民医院骨外一科，湖北 仙桃 433000；2.苏州大学附属第一医院骨科，江苏 苏州 215006)

关节置换术是治疗关节损伤疾病的最重要手段，但假体周围骨溶解导致人工关节无菌性松动仍是关节置换术后最常见的并发症[1-2]。植入物释放的聚乙烯、磷酸三钙等特殊磨损颗粒通过刺激巨噬细胞，诱导种植体周围颗粒状炎症，从而导致骨裂发生和随后的骨溶解[3-4]。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)、NF-kappa B的受体激活因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)和RANK配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)在破骨细胞的生理和病理发育过程中均发挥着重要作用[5]。RANKL与RANK结合，促进破骨细胞活化[6]。OPG与RANK竞争RANKL，从而抑制破骨细胞生成和骨吸收[7]。研究表明，外源性OPG可以阻断大鼠卵巢切除相关的骨质流失，提示其对骨质疏松症等发生系统性骨质流失的疾病有重要作用[8]。然而OPG在局部病理性骨丢失中的作用还需要进一步研究。因此，本研究采用磷酸三钙磨损颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型，检测OPG对假体周围骨溶解的影响，探讨RANKL/RANK/OPG信号通路在假体周围骨溶解中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 昆明种小鼠(苏州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2017-0011)；磷酸三钙磨损颗粒(浙江大学化学系)；OPG(美国Sigma公司)；3%戊巴比妥(购于上海上药新亚药业有限公司)；白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒(大连TaKaRa公司，中国)、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒(宝生物工程大连有限公司，中国)、PCR引物序列(大连TaKaRa公司，中国)：RANKL上游引物为5’-CACTATTAATGCCACCGAC-3’、下游引物为5’-GGGTATGAGAACTTGGGATT-3’；RANK上游引物为5’-ATGCGGTTTGCAGTTCTTCTC-3’、下游引物为5’-ACTCCTTATCTCCACTTAGG-3’；OPG引物序列：上游引物为5’-GCTTGAAACATAGGAGCTG-3’、下游引物为：5’-GTTTACTTTGGTGCCAGG-3’；GAPDH引物序列：上游引物为5’-CAGAACATCATCCCTGCCTCT-3’下游引物为：5-GCTTGACAAAGTGGTCGTTGAG-3’；电子天平(上海梅特勒公司，中国)；组织脱水机、包埋机、全自动轮转切片机等病理配套设备(德国Leica公司)；光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；HBS-1096B酶标仪(南京德铁实验设备有限公司)；NanoDrop2000c型蛋白核酸检测仪(美国Thermo公司)、实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 实验分组及造模 选取雄性6周龄小鼠30只，体重18～22 g，在SPF级的环境中饲养，动物相关处置均符合《中华人民共和国实验动物管理条例》要求，适应性喂养1周后进行实验。对小鼠进行编号，用随机数字表法将小鼠随机分为假手术组、模型组和OPG组，每组10只。腹腔注射3%戊巴比妥钠(35 mg/kg体重)进行麻醉，剔除小鼠头顶毛发，进行消毒，沿颅顶正中矢状切口(10 mm左右)，分离皮下组织，暴露颅骨(大小约1 cm×1 cm)。假手术组在无任何进一步干预的情况下关闭切口。模型组和OPG组取30 mg磷酸三钙磨损颗粒置于颅顶后关闭切口。OPG组于术后第2天在颅顶局部注射OPG(3 mg/kg)，每隔2天1次；假手术组和模型组给予等量生理盐水，共2周。处死小鼠后进行相关检测。

1.3 HE染色观察破骨细胞 分离颅骨，进行甲醛固定48 h，用microCT扫描选颅骨相同位置的感兴趣区域)进行三维重建；用10%盐酸进行脱钙，经脱水、包埋，切成厚度为3 μm切片，进行染色，在显微镜下观察病理变化。选出一个具有代表性的图像。用Image Pro-Plus 5.0计算矢状缝区域3核及以上破骨细胞数。

1.4 TRAP染色观察骨溶解 颅骨进行病理切片后，经脱蜡和乙醇梯度脱水后自然晾干，加入TRAP染色1h，双蒸水清洗后置于显微镜下观察小鼠颅骨溶解情况，用UTHSCA Image Tool测定骨溶解面积。

1.5 ELISA法检测颅骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 每组随机取3只小鼠颅骨骨膜组织，剪碎后用RIPA裂解液进行裂解，12 000 r/min离心15 min后收集上清，按照ELISA试剂盒的操作说明书进行上述炎症因子的检测。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测颅骨中RANKL、RANK和OPG mRNA的水平 每组随机取3只小鼠颅骨组织，剪碎后在液氮作用下充分研磨后加入Trizol 1 mL，根据RNA提取试剂盒操作说明书，加入氯仿、无水乙醇等试剂提取RNA，根据RNA反转录试剂盒说明书在37℃ 60 min，95℃ 5 min的逆转录条件下合成cDNA，将cDNA置于-20℃保存备用；根据荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR扩增，扩增条件为95℃预加热15 min，一个循环；94℃ 15 s，65℃ 30 s，72℃ 34 s，40个循环。每个标本做3个复孔。用实时荧光定量PCR仪检测对其表达量进行结果分析，以GADPH作为内参，采用2-△△Ct法计算mRNA的相对表达量。

2 结 果

2.1 三组小鼠假体周围破骨细胞形成和骨溶解的变化情况 与假手术组比较，模型组和OPG组小鼠颅骨破骨细胞数和骨溶解面积均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，OPG组小鼠颅骨破骨细胞数和骨溶解面积均减少，差异有统计学意义(P<0.05，见表1，见图1～3)。

表1 三组小鼠假体周围破骨细胞形成和骨溶解的变化情况

a 假手术组 b 模型组 c OPG组

a 假手术组

b 模型组

c OPG组

a 假手术组

b 模型组

c OPG组

2.2 三组小鼠颅骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的变化情况 与假手术组比较，模型组和OPG组小鼠颅骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，OPG组小鼠颅骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平减少，差异有统计学意义(P<0.05，见表2)。

表2 三组小鼠颅骨骨膜中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的变化情况

2.3 三组小鼠颅骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的变化情况 与假手术组比较，模型组和OPG组小鼠颅骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相对表达量均增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，OPG组小鼠颅骨中RANKL、RANK、OPG mRNA的相对表达量均降低，差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。

表3 三组小鼠颅骨中RANKL、RANK和OPG mRNA水平的变化情况

3 讨 论

关节置换术中植入物长期失效的主要原因是关节面诱导的骨溶解导致无菌性松动[9]。破骨细胞形成关键介质(RANKL、RANK、OPG)的失衡与此过程有关[10]。本研究证明外源性OPG可以有效预防和治疗磷酸三钙磨损颗粒诱导的骨溶解。

磨损颗粒诱导骨溶解的小鼠模型是基于磨损颗粒和碎片[11]。本研究使用磷酸三钙磨损颗粒，因为其是临床实践中最常见和与生物相关的磨损碎片来源之一，我们希望更真实地模拟临床场景。在本研究中，模型组破骨细胞生成和骨吸收增强，远高于假手术组水平。外源性OPG的加入显著抵消了磨损颗粒的不良相关效应，提示OPG治疗可有效抑制颗粒诱导的破骨细胞生成和骨吸收。

破骨前细胞需要表达RANK才能发育成成熟的破骨细胞，而表达RANK mRNA的细胞确实是从含有颗粒的翻修组织中分离出来的[12]。翻修组织中的单核细胞/巨噬细胞可能是破骨细胞的前体，因为来自不同组织的这个谱系的细胞可以在成骨细胞或溶血细胞存在的情况下分化为破骨细胞[13]。颗粒刺激单核细胞在体外表达RANK和RANKL，在体内表达巨噬细胞修饰组织，提示这些分子可能在关节周组织破骨细胞的产生中起关键作用[14]。虽然RANKL在关节周的水平可能是决定破骨形成的关键，但OPG的水平也很重要。众所周知，OPG在破骨细胞前参与RANKL与其受体(RANK)结合的竞争[15]。由于RANKL/OPG比值失衡与假体周围骨溶解伴无菌性松动密切相关，因此基因治疗可能是一种潜在的治疗策略[16]。RANKL/OPG比值被认为是调节骨吸收的关键参数，与多种骨代谢异常和骨紊乱相关。在以前的研究中，磨屑被证明能增加小鼠的RANKL和RANK水平[17]。如果提高OPG水平，那么RANKL的破骨作用将会减弱。同时，磨损颗粒可激活的巨噬细胞释放TNF-α、IL-6和IL-1β等多种促炎细胞因子释放[18]。这些炎症因子的高水平表达可以通过其他信号通路激活成骨细胞的分化和成熟，诱导骨溶解，从而导致局部OPG表达的选择性升高。然而，与假手术组相比，模型组中RANKL表达上调更为明显，导致界面膜中RANKL/OPG比值显著升高。给予内质网膜定位的活化转录因子6(ATF6)的特异性阻断剂4-苯基丁酸能显著减少小鼠假体周围骨膜中IL-6、IL-1β、TNF-α和RANKL的产生，抑制骨溶解[19]。我们的研究也得出相似的结论。

综上所述，通过给予外源性OPG能显著抑制磷酸三钙磨损颗粒诱导的骨溶解，为关节置换术后假体周围骨溶解和关节松动治疗提供了理论依据，可作为假体周围骨溶解和关节松动新的干预和治疗靶点，最终提高置换关节的寿命。