PCR技术在食品微生物检测中的应用

曹欢欢

朝阳市检验检测认证中心 辽宁朝阳 122000

PCR技术主要是通过聚合酶链式反应来对食品微生物进行检测，当前有了较为广泛的应用，己经成为食品微生物检测的主要手段之一。通过PCR技术，能够让食品微生物检测的精准程度及效率得到提升，最大化地保障了人民群众的饮食安全。

1 PCR技术概述

1.1 常规PCR检测原理

在常规PCR检测的过程中，必须按照DNA模板作为缓冲液，利用DNA的聚化酶催化增加寡核苷酸的片段，形成完整的生物周期循环模型样片，保证检测的效果更加精确。常规PCR沙门氏菌检测总检出率大约为99．8%，能够对630株沙门氏菌以及100多种血清进行准确检测。

1.2 多重PCR检测技术的概述

PCR中文名称为聚合酶链式反应，其主要是指在体外条件下，模板DNA在聚合酶的作用下进行复制的技术，其过程主要为变性、退火与延伸。双链DNA通过热变性会形成单链DNA，然后其和引物进行结合，受到聚合酶的作用，核苷酸顺着DNA单链逐渐延伸最终形成双链，再将其当作模板产生新的DNA双链，如此不断循环。总体来说，多重PCR在某一反应体系之中加入超过两对引物（包括两对），从而产生更多的DNA序列[1]。

1.3 巢式PCR

巢式PCR能够利用两种不同的引物最DNA检测片段进行扩充，利用第1套引物扩张15-30个基因循环，然后根据DNA片段设定第2套引物，同样扩增15-30个循环，第2套引物即为内引物。通过超巢式PCR能够全面增强反应的特异性，也能够增强物异性和敏感性，对微生物的检测和DNA的扩增具有非常明显的效果。

通常情况下，巢式PCR技术在第1次扩张中必须打开反应管，然后除去第2套引物才能够增加第2套引物，所以巢式PCR自身的操作非常复杂。利用巢式PCR技术可以确保外引物的温度明显上升，并且直接将两套引物同时增加到PCR反应之中，如果内引物不能够继续结合，则形成双霉链，确保整个引物反应系统稳定性增强。在引物扩增完毕后才能够进入低火温皮下循环，在低温作用下内隐物会开始工作，如此的反复循环能够快速的降低变性温度，避免巢式PCR在循环的过程中产生产物检验。

2 PCR技术在食品微生物检测中的应用检测

2.1 检测大肠杆菌检

大肠杆菌具备一定的毒素，并且这类毒素还有着一致性，采取传统的血清法微生物检测方式不能够对其进行准确的检测。通过PCR技术，能够有效检测出大肠杆菌。与传统检测技术不同，PCR技术主要是对大肠杆菌的DNA双链进行检测，很大程度上保证了检测的准确性。同时，部分技术人员将免疫磁分离技术与PCR技术相结合，在牛肉之中成功检测到了大肠杆菌，并通过stx，、stx2、hly等基因来对大肠杆菌的类型进行了分析。

2.2 检测沙门氏菌

在对食品进行制作与加工时，会让其中所含有的沙门氏菌含量减少，故而沙门氏菌在食品中的含量相对较少，在这样的背景之下，检测食品中的沙门氏菌就具备较高的难度。通过PCR技术进行检测，一般选择iNVA、B、C、E等特异性引物，来建立多重的PCR。从检测结果能够看出，一重、二重PCR之间并未存在着较大的差异，但采用三重PCR则相对来说更为准确[2]。

2.3 检测金黄色葡萄球菌

一般检测法是检测食品中金黄色葡萄球菌最常用的一种方法，首先，在无菌的环境下采取二十五克样品食物，然后加入适当含量的氯化钠肉汤，搅拌稀释后形成1/10稀释液，其次，将制作好的稀释液放置于36摄氏度左右的环境中，培养18至24小时，培养完成后将稀释液用平板画线法在血平板上画线处理，再次在36摄氏度的环境中培养18至24小时。最后，经过培养的平板上会出现一些颜色为灰黑色，呈圆形，并且周围有些许杂质和一层透明带的物质，将这些物质采集下来经过显微镜检查和凝固酶实验就可以得到食品的金黄色葡萄球菌检测。在金黄色葡萄球菌的生物分子检测方法中，PCR检测法是最主要的一种方法，PCR检测法则既能检测到活的金黄色葡萄球菌，又能检测到死的金黄色葡萄球菌。因此，PCR检测法与其他检测方法相比较而言所得到的结果更加精准，并且能在短时间内得到检测结果[3]。

2.4 检测乳酸菌

与常规qPCR技术相类似，目前PMA-qPCR技术检测单一乳酸菌的活菌数量已经在很多乳酸菌菌株中研究成功，如副干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和双歧杆菌BB12等。我国张和平团队也报道了PMA-qPCR技术检测植物乳杆菌P-8的研究。Desfossés-Foucault等在定量检测鼠李糖乳杆菌时，还设计了一条探针引物以进一步确保对目标菌株计数的灵敏性和准确性。但是，由于在乳酸菌食品中，一般是多种乳酸菌混合添加的，因此，同时检测不同种乳酸菌的活菌数将更符合乳酸菌检验的实际需要。Zorica等报道了利用设计的兼并引物，同时对Lb．plaNtarum 564和 Lb．paracasei Z-8 进行检测。

3 结语

随着食品微生物检测技术的快速发展，如何提高检测的效率和精确度已经成为食品微生物检测发展的重要因素，目前PCR技术在实践和应用的过程中还存在某些缺陷，但是随着PCR技术的快速发展与完善，食品微生物检测的整体水平也会不断提升。总而言之，微生物的快速检测在食品卫生微生物检测方面的作用越来越重要，PCR技术能够融合免疫学分子生物学计算机技术，快速建立食品微生物检测模型，确保食品微生物检测标准更高、效率更高、敏灵敏度更高，为我国的食品安全做出重要的贡献。