高效液相色谱串联质谱法检测马铃薯及马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱含量

,3,3,3，*

(1.农业部农产品质量监督检验测试中心(北京),北京 100083;2.农业农村部科技发展中心,北京 100045;3.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)

马铃薯(Solanumtuberosum)是茄科多年生草本植物,在世界范围内广泛种植[1]。由于其耐干旱,稳产高产,抗灾力强,成为世界上仅次于小麦、水稻、玉米的第四大粮食作物[2],距今已有7000多年的栽培历史[3]。由于马铃薯营养均衡、产业链长等特点,被广泛应用于主食消费和加工利用,是欧美、非洲等70多个国家的主食作物[4]。

茄碱是存在于马铃薯中的天然的甾体糖苷类生物碱毒素,又名龙葵碱、龙葵素,主要由葡萄糖残基和茄啶组成的一种弱碱性糖苷[5]。马铃薯中的茄碱主要是α-茄碱(α-solanine)和α-卡茄碱(α-chaconine)[6],其含量占糖苷类生物碱总量的90%以上[7]。在马铃薯的芽、未成熟块茎、成熟薯皮及靠近薯皮的组织中含量较高[8]。茄碱通过抑制胆碱酯酶活性而对胃肠道黏膜有较强的刺激性和腐蚀性[9]、对中枢神经有麻痹作用、对红细胞有溶血作用[10],可引起急性脑水肿、胃肠炎等。中毒的主要表现为胃痛加剧,恶心呕吐,呼吸困难,伴随全身虚弱和衰竭[11],也可以致畸[12],导致脑畸形和脊柱裂[13],严重可导致死亡[14]。由此可见,茄碱中毒是不容忽视的食品安全问题[15]。

目前茄碱提取方法主要有匀浆提取法[16]、超声提取法[17]、微波辅助提取法[18]、搅拌浸提法[19]、回流提取法等[20],检测方法多采用高效液相色谱[21-24],液相色谱串联质谱联用法[25-28]。传统的提取方法多采用酸提碱沉的方法,时间长、步骤复杂,回收率偏低,而用液相色谱方法时,检测波长在紫外区,易受到杂质干扰,难以用于较复杂样品的检测。此外,马铃薯中茄碱的检测方法较为陈旧,我国现有的茄碱检测方法不完善,因此,如何改进马铃薯中茄碱的提取条件、提高回收率,建立新的检测技术,已成为该研究领域急待解决的问题[29]。

本文通过乙酸水溶液对马铃薯及马铃薯粉中的α-茄碱和α-卡茄碱进行提取,马铃薯样品提取后直接过膜上机,马铃薯粉采用C18 SPE柱净化后即可过膜上机,操作简便、高效、快速,避免了超声、振荡、回流和离心等耗时长的前处理方式;采用高效液相色谱-串联质谱法检测,重复性好、精密度好、检测效率高,不但可以避免了杂质干扰的影响,还可以完成α-茄碱和α-卡茄碱的同时检测,为低含量茄碱的检测提供了准确可靠的实用方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯及马铃薯粉 购自超市,马铃薯编号为S1～S12,马铃薯粉编号为S13～S15。甲醇、乙腈、无水乙醇、甲酸和冰乙酸 色谱纯;甲酸铵 分析纯;α-茄碱(20562-02-1,纯度≥99%)和α-卡茄碱(20562-03-2,纯度≥99%) 北京百灵威科技有限公司;Milli Q超纯水。

Agilent 1260/6460高效液相色谱-串联质谱仪 安捷伦科技有限公司;T25高速匀浆机 北京德泉兴业商贸有限公司;RE-52AA旋转蒸发仪 上海振捷实验设备有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;C18固相萃取柱柱(500 mg/3 mL) 安捷伦科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 质谱条件优化 采用直接进样的方式,分别在正离子和负离子模式下对α-茄碱和α-卡茄碱的标准溶液进行扫描,优化质谱条件。

1.2.2 色谱条件优化 实验比较了0.1%甲酸-乙腈,2 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈、5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈,10 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)等流动相体系对其分离效果的影响。

1.2.3 马铃薯中茄碱的提取方法 马铃薯去掉表面泥土,切块后制成匀浆,称取5.0 g匀浆后的样品于200 mL烧杯中,加入不同比例的提取溶剂,采用不同的方法进行提取,提取液定容至100 mL,上机前取2 mL提取液用流动相定容至10 mL,过0.22 μm微孔滤膜后分析。

1.2.3.1 提取溶剂优化 分别用乙酸-水-NaHSO3(5/100/0.5,v/v/w)、5%乙酸水溶液、10%乙酸水溶液、15%乙酸水溶液、1%乙酸乙醇溶液、5%乙酸乙醇溶液和10%乙酸乙醇溶液等7种溶液作为提取剂对马铃薯中茄碱进行提取,比较不同提取溶剂的提取效果。

1.2.3.2 提取方式的优化 分别采用匀浆提取[16]、超声提取[17]、回流提取[20]及振荡提取[27]方式对马铃薯中的茄碱进行提取,比较不同提取方式的提取效果。

1.2.3.3 料液比的优化 采用匀浆提取方式,以1∶2、1∶3、1∶5、1∶10等不同料液比对马铃薯中茄碱提取效果的影响。

1.2.3.4 提取时间的优化 以10%的乙酸水溶液为提取液,料液比为1∶10,采用匀浆提取方式,比较提取为1、2、3、4 min的提取效果。

1.2.4 马铃薯粉中茄碱的提取方法 称取1.0 g马铃薯粉于200 mL烧杯中,加10 mL的10%乙酸水浸泡30 min,再加40 mL的10%乙酸水,匀浆提取3 min,转移至100 mL容量瓶中,用10%乙酸水定容。

1.2.5 净化条件的优化 取马铃薯粉提取液30 mL于离心管中,10000 r/min离心5 min。取上清液5 mL加到预先用5 mL甲醇,5 mL 10%乙酸水溶液活化的固相萃取柱中,5 mL 15%甲醇水溶液淋洗,分别用不同洗脱液进行洗脱。取1 mL洗脱液用流动相稀释10倍后,过0.22 μm微孔滤膜后进行分析。

1.2.6 色谱条件

1.2.6.1 液相色谱条件 色谱柱:Agilent C18柱(100 mm×3.0 mm,2.7 μm);流动相A为5 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%甲酸),流动相B为乙腈;梯度洗脱条件:78%的A保持2 min,5 min后变为65%的A保持2 min;柱温30 ℃;进样量3 μL;流速0.30 mL/min。

1.2.6.2 质谱条件 毛细管电压:3.5 kv;喷嘴电压:500 V;干燥气体温度:350 ℃;干燥气流量:10 L/min;鞘气温度:300 ℃;鞘气流速:11 L/min。

1.2.7 标准溶液配制 分别称取α-茄碱和α-卡茄碱标准品10.0 mg,加甲醇溶解并定容至10.0 mL,配成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液。吸取α-茄碱和α-卡茄碱标准储备液,用甲醇逐级稀释,配制成浓度分别为0.010、0.025、0.050、0.10、0.25、0.50和1.00 μg/mL的混合标准工作液。

1.2.8 样品中茄碱含量计算

其中,X为试样中待测组分含量,单位为毫克每千克(mg/kg);ρ为标准曲线得出的试样中α-茄碱或α-卡茄碱的质量浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V为试样定容体积,单位为毫升(mL);m为试样的质量,单位为克(g);f为稀释倍数;1000为单位换算系数。

1.2.9 方法的准确度和精密度 分别按1.2.3和1.2.4称取一定量的马铃薯及马铃薯粉样品于烧杯中,添加一定浓度的α-茄碱和α-卡茄碱的标准溶液,使马铃薯中α-茄碱和α-卡茄碱添加水平分别为5.00、20.0和50.0 mg/kg;马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱的添加水平分别为50.0、100和200 mg/kg,放置30 min后,按所建立的方法进行提取测定,计算样品的添加回收率。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

分别在正离子和负离子模式下对α-茄碱和α-卡茄碱进行母离子扫描,设置扫描范围为300～900 amu,结果表明,两种茄碱在正离子模式下响应较高。确定扫描方式、母离子后,优化碎裂电压、碰撞能量,优化后的多反应监测参数见表1。

表1 α-茄碱和α-卡茄碱多反应监测参数Table 1 Parameters of MRM for α-solanine and α-chaconine

注:*为定量离子。

2.2 流动相的优化

α-茄碱和α-卡茄碱结构类似,在色谱中的保留时间相近,为了达到较好的分离效果,提高离子化效率,实验对流动相组成及洗脱条件进行了优化。结果表明,流动相中加入甲酸铵后α-茄碱和α-卡茄碱分离度增加。随着甲酸铵浓度的增加,α-茄碱的响应值有所提高而α-卡茄碱的响应值有所下降。综合考虑响应值和分离度的影响,实验选择5 mmol/L甲酸铵(含0.1%甲酸)-乙腈作为流动相。α-茄碱和α-卡茄碱标准溶液总离子及提取离子色谱图见图1。

图1 α-茄碱和α-卡茄碱标准溶液总离子及提取离子色谱图 Fig.1 MRM chromatograms of α-solanineand α-chaconine standard solution

2.3 提取方法的优化

2.3.1 提取溶剂的优化 提取溶剂优化结果见图2。溶剂的选择参考国内外的相关文献[16-27],主要是由乙酸、乙醇、水组成的体系[16-17,27],其中乙酸-水-NaHSO3(5/100/0.5,v/v/w)为美国分析化学家协会(AOAC)方法中[16]的提取溶液。

图2 提取溶剂对马铃薯中茄碱提取效果的影响Fig.2 Effect of extraction solventon solanine extraction in potato

从图2中可以看出,随着乙酸浓度的提升,茄碱的含量也在逐步增加,这与茄碱具有弱酸性,在酸性条件下能成盐,增加其溶解度有关。以乙酸水溶液为提取溶剂要优于乙酸乙醇;未加亚硫酸氢钠的乙酸水溶液的提取效果更好。在酸水体系中,虽然15%乙酸水提取的茄碱含量略高,但是差异并不显著,实验最终选用10%的乙酸水溶液作为提取溶剂。

2.3.2 提取方式的优化 提取方式对马铃薯中茄碱提取效果的影响见表2。

表2 提取方式对马铃薯中茄碱提取效果的影响Table 2 Effect of extraction methodon solanine extraction in potato(n=3)

从表2中可以看出,匀浆提取的效果明显高于其他的提取方式,匀浆提取3 min的提取效果大于加热回流5 h,也高于振荡提取2 h的效果;超声提取40 min效果优于60 min,这可能是超声时间过长时,超声波的机械、空化效应可能破坏生物碱的结构[15]。实验最终选择匀浆3 min的提取方式。

2.3.3 料液比的优化 料液比的优化结果见图3。从图3中可以看出,随着料液比的增加,样品含量略有增加,当料液比提高至1∶10时,提取效果与料液比为1∶5时无明显差异,考虑到不同品种马铃薯中茄碱含量的差异及匀浆时提取液的体积,试验最终选择提取料液比1∶10。

图3 料液比对马铃薯中茄碱提取效果的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratioon solanine extraction in potato

2.3.4 提取时间的优化 不同提取时间对马铃薯中茄碱提取效果见图4。从图中可以看出,随着提取时间的增加,α-茄碱和α-卡茄碱的含量略有增加,提取3和4 min的提取效果比较无明显差异。考虑提取时间和提取效果等因素,实验最终确定提取时间为3 min。

图4 提取时间对马铃薯中茄碱提取效果的影响Fig.4 Effect of extraction timeon solanine extraction in potato

2.3.5 净化条件的优化 马铃薯粉为加工产品,在生产过程中可能添加糖、盐及其他化合物,为了减少基质干扰,采用C18固相萃取柱对样品提取液进行净化,实验比较了不同洗脱液对洗脱效率的影响,结果见表3。

表3 洗脱液对茄碱提取效果的影响Table 3 Effect of eluent solution on solanine extraction

含磷酸盐的洗脱液为AOAC方法中使用的,回收率较好,但该方法净化后用高效液相色谱法检测。为减少磷酸盐对液相色谱质谱系统的影响,实验将磷酸盐缓冲液替换为水,但回收率明显下降。将洗脱溶剂换成乙醇水体系时发现,随着洗脱中乙醇含量的增加,柱回收有所增加,而当乙醇的含量为100%时,洗脱能力反而下降。实验最终选择了含90%乙醇水溶液(含1%甲酸)作为洗脱液。

2.3.6 基质效应评价 按1.2.7的浓度水平分别用溶剂和马铃薯及马铃薯粉的基质配制α-茄碱和α-卡茄碱的混合标准工作液,进行色谱-质谱分析,计算基质效应。基质效应(%)=(基质标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)×100来计算。

结果表明,马铃薯中α-茄碱和α-卡茄碱的基质效应分别为4.73%和3.85%;马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱的基质效应分别为2.04%和2.15%,均小于±20%,基质效应较弱,因此可以用溶剂标准进行样品的定量分析。

2.4 线性范围和定量限

将混合标准工作液进入液相色谱串联质谱中,以浓度为横坐标,定量离子峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,α-茄碱和α-卡茄碱在0.01～1.00 μg/mL范围内线性良好,α-茄碱线性方程为y=8393843x-93195,相关系数r=0.9998;α-卡茄碱线性方程为y=17650992 x-199331,相关系数r=0.9997。以10倍信噪比计算,马铃薯α-茄碱的定量限为0.80 μg/kg,α-卡茄碱的定量限为0.42 μg/kg;马铃薯粉α-茄碱的定量限为25 μg/kg,α-卡茄碱的定量限为14 μg/kg。

2.5 方法的准确度和精密度

方法的准确度采用添加回收的方式进行评价,马铃薯及马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱的添加回收率和精密度测定结果见表4。

表4 马铃薯及马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱的添加率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of α-chaconine and α-solanine in potato and potato powder(n=6)

从表4中可以看出,马铃薯中α-茄碱和α-卡茄碱添加回收率在90.1%～107%之间,RSD在1.7%～5.0%之间;马铃薯粉α-茄碱和α-卡茄碱添加回收率在90.0%～110%之间,RSD在1.6%～4.9%之间,满足样品测定的要求。

2.6 市售样品分析

采用本实验建立的方法,对市售12个马铃薯样品和3个马铃薯粉进行了检测,结果见表5。从表中可以看出马铃薯中α-茄碱的含量在8.11～40.8 mg/kg之间,α-卡茄碱的含量在14.2～52.6 mg/kg之间。马铃薯粉中α-茄碱的含量在91.7～140 mg/kg之间,α-卡茄碱的含量在95.9～400 mg/kg之间。总体看α-卡茄碱的含量高于α-茄碱的含量。

表5 市售样品中茄碱的检测结果Table 5 Determination of Solaninein commercial samples(n=3)

3 结论

本文建立了高效液相色谱串联质谱法同时测定马铃薯及马铃薯粉中α-茄碱与α-卡茄碱含量的方法。方法采用匀浆提取方式,提取时间仅需3 min;在低、中、高三个添加水平的RSD均小于5%;马铃薯中α-茄碱和α-卡茄碱的定量限分别为0.80和0.42 μg/kg,马铃薯粉中α-茄碱和α-卡茄碱的定量限分别为25和14 μg/kg。方法简单快速,重复性好,灵敏度高,可操作性强,适用于马铃薯及马铃薯粉中的α-茄碱和α-卡茄碱的同时检测。对市售12种马铃薯样品和3种马铃薯粉进行检测,马铃薯中α-茄碱的含量在8.11～40.8 mg/kg之间,α-卡茄碱的含量在14.2～52.6 mg/kg之间;马铃薯粉中α-茄碱的含量在91.7～140 mg/kg之间,α-卡茄碱的含量在95.9～400 mg/kg之间。