一月龄婴儿粪便菌群对五种非消化糖的体外发酵作用

梁 玉,赵鹏昊,尚佳萃,刘瑞娜,贺 菁,侯雨佳,孟祥晨

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

婴儿时期为肠道菌群定植的关键窗口时期,肠道菌群对婴儿早期免疫系统、消化系统的发育及成年后机体的生理状况均有深远的影响。肠道菌群的生态失调与各种疾病相关,包括肥胖、高血压、心血管疾病、糖尿病、癌症、炎症性肠病、痛风、抑郁症等[1]。

膳食中的非消化糖不会被消化酶分解,因此非消化糖可通过胃和小肠并最终作为肠道菌群发酵的底物,生成促进机体健康的代谢产物,并形成肠道特定的微环境[2]。肠道菌群可合成多种碳水化合物降解酶,因此肠道菌群能较好地利用非消化糖[3]。

肠道菌群依靠非消化糖提供能量来源,同时,非消化糖的摄入是肠道菌群生态、多样性和功能的关键决定因素[4]。Peril等[5]研究低聚半乳糖对肠道菌群的影响,研究发现低聚半乳糖可增加粪便菌群中双歧杆菌属和乳杆菌属的相对丰度。Andenplas等[6]研究添加低聚果糖和低聚半乳糖的婴幼儿配方奶粉对婴幼儿肠道菌群的影响,结果表明非消化糖的加入均可软化粪便、降低粪便pH、提高管腔渗透水结合能力和提高婴幼儿粪便中短链脂肪酸的含量。Oliveira等[7]研究发现,在低脂牛奶中添加菊粉,可促进食用者肠道菌群中嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和双歧杆菌的生长。国内外学者的研究多集中于月龄较大的婴幼儿及成人对非消化糖的发酵作用,而对于一月龄婴儿粪便菌群对非消化糖的发酵作用的对比还未见报道。

本研究的主要目的是解析一月龄婴儿粪便对低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖五种非消化糖的发酵作用,通过体外发酵方式揭示并对比各种非消化糖与婴儿肠道菌群间的互作,对一月龄婴儿膳食中非消化糖的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低聚果糖(纯度≥95%)、低聚半乳糖(纯度≥98%)、低聚木糖(纯度≥95%)、菊粉(纯度≥99%)、聚葡萄糖(纯度≥99%) 上海源叶生物科技有限公司;乳酸、乙酸、丙酸及丁酸标准品(色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒、SuperReal PreMix Plus、质粒小提试剂盒 北京天根生化科技有限公司;pMD 19-T simple vector 大连宝生物工程有限公司;其他试剂 均为分析纯。

Waters 2695型高效液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器和色谱工作站) 美国Waters公司;BCN1360型生物洁净工作台 上海佳胜实验设备有限公司公司;1029型厌氧培养箱 Thermo Fisher Scientific;DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司;GL-21 M高速冷冻离心机 上海市离心机械研究所;HVE-8D型全自动高压灭菌锅 日本HIRAYAMA;AF100型制冰机 SCOTSMAN公司;DYY-10C型电泳仪 北京市六一仪器厂;微量台式离心机 Microfuge20R,美国Beckman公司;StepOnePlus实时荧光定量PCR仪 美国应用生物系统公司;NanoDrop 1000超微量分光光度计 美国 Nanodrop公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外发酵培养基的配制 根据Yan等[8]体外发酵培养方法配制基础培养基,培养为蛋白胨2.0 g/L、酵母提取物2.0 g/L、NaCl 0.1 g/L、K2HPO40.04 g/L、MgSO40.01 g/L、CaCl20.01 g/L、NaHCO32.0 g/L、血红素0.02 g/L、半胱胺盐酸盐0.5 g/L、胆盐0.5 g/L、刃天青1.0 mg/L、吐温80 2.0 mL/L、维生素K 10 μL/L。分别称取50 mg低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖做培养基中唯一碳源,加入到含4.5 mL基础培养基的10 mL西林瓶中;空白对照不加入任何碳源,于121 ℃、高压灭菌15 min备用。

1.2.2 粪便菌悬液的配制 选择3位无胃肠道疾病及抗生素治疗史的一月龄健康婴儿为受试者。收集受试者的新鲜粪便,且于排便后2 h内处理粪便样品,分别将样品称重并用无菌磷酸盐缓冲液1∶10 (w/v)稀释[9]。充分振荡后,经4层纱布过滤制成粪便菌悬液[10]。

1.2.3 粪便菌群对非消化糖的发酵 接种粪便菌悬液:分别向配制好的体外发酵培养基中加入0.5 mL粪便菌悬液[11],充分振荡。接种完成后,厌氧培养并于37 ℃发酵24 h,得到粪便发酵液样品。

1.2.4 粪便发酵液中部分细菌的检测

1.2.4.1 细菌DNA的提取 参照天根细菌DNA提取试剂盒说明书提取粪便发酵液中细菌总DNA。提取后放置于-80 ℃保存备用。

1.2.4.2 部分细菌的绝对定量 选择粪便中的主要细菌(双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、肠球菌属、肠杆菌属、梭菌属)的高效特异性引物,并进行验证(表1)。对上述细菌进行绝对定量qPCR,反应体系:样本DNA模板2 μL;SYBR Green Super Mix 10 μL;上、下游引物各 0.7 μL;50×ROX Reference Dye 1 μL;灭菌蒸馏水5.6 μL;扩增条件:95 ℃预变性15 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,40个循环,每个样本重复检测3次。将扩增的六种目的基因连接于pMD 19-T载体上,然后转化到DH5α宿主中。测定转化成功的阳性质粒浓度,根据分子质量计算拷贝数,并进行梯度稀释,作为绝对定量qPCR的标准物,制备标准曲线[12]。将1.2.4.1中提取的粪便发酵液样品细菌DNA进行荧光定量PCR检测,操作方法和条件与标准曲线制作时一致。待测样品的Ct值结合标准曲线即可计算出各样品中六个目标细菌的含量[13]。

表1 细菌16S rDNA引物序列Table 1 Primer pairs for bacterial 16S rDNA

1.2.5 乳酸及短链脂肪酸含量的测定 分别取乳酸、乙酸、丙酸和丁酸标准品,加去离子水配制为50 mmol/L的标准储备液,稀释至合适浓度并混合作为液相色谱的混合标准品。

取2 mL培养完成的粪便发酵液分别于13000 r/min离心15 min,除去菌体及其他颗粒物[10]。取1.5 mL发酵上清液经0.22 μm滤膜过滤后,使用液相色谱仪检测乳酸及短链脂肪酸。

高效液相色谱条件:色谱柱BIO-RAD Aminex HPX-87H柱(300 mm×78 mm,9 μm)。流动相为5 mmol/L的H2SO4,流速为0.5 mL/min,柱温为50 ℃,进样量为10 μL,210 nm紫外检测器[11]。

定性与定量:以乳酸、乙酸、丙酸、丁酸标准品的保留时间和峰面积对非消化糖发酵后所含的有机酸进行定性和定量分析。

1.3 统计学分析

上述实验均独立重复三次,采用SPSS 24软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)分析方差,采用 Duncan法进行多重比较,P<0.05为差异显著。试验数据表示为“平均值±标准差”。

2 结果与讨论

2.1 主要目标细菌的标准曲线

六种引物经qPCR熔解曲线分析,熔解曲线均为单峰(图略),说明扩增产物单一,产物均为目的DNA片段。采用实验方法中所述的qPCR扩增条件,建立拷贝数的对数和定量PCR反应过程中达到荧光阈值的初始循环数(Ct)的回归方程(表2),在测定范围内各样品均具有较好的线性关系,R2均在0.99以上。

表2 菌属含量的回归方程及决定系数Table 2 Regression equation for bacterialcontent and determination coefficient

注:表中x代表标准物拷贝数的对数,y代表达到荧光阈值的初始循环数(Ct)。

2.2 五种非消化糖经一月龄婴儿粪便菌群发酵后发酵液中主要细菌的含量

低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、聚葡萄糖、菊粉对一月龄婴儿粪便菌群中主要细菌的作用有所差异(表3、图1)。五种非消化糖均能促进婴儿粪便菌群中乳酸杆菌、双歧杆菌的生长,其中低聚果糖对乳杆菌和双歧杆菌的促进作用最强(P<0.05),与不含碳源的空白组中菌属含量的比值分别为1.07、1.12。表3可知一月龄婴儿粪便发酵五种非消化糖后,粪便发酵液中的双歧杆菌含量均高于乳杆菌。菊粉可以显著促进拟杆菌的生长(P<0.05),与空白组中菌属含量的比值为1.15。五种非消化糖均能抑制梭菌属的生长(P<0.05),低聚果糖对其抑制作用最强,与空白组中菌属含量的比值为0.92。低聚半乳糖可显著抑制粪便菌群中肠杆菌的增殖,与空白组中菌属含量的比值为0.98。低聚木糖可显著减少粪便发酵液中肠球菌的含量(P<0.05),与空白组中菌属含量的比值为0.97。

图1 粪便菌群发酵五种非消化糖后发酵液中主要细菌含量与空白组的比值Fig.1 The ratio of main bacterial content in the fermentedfive non-digested polysaccharides to the blank group

婴儿肠道菌群的定殖与发展是连续的动态变化的过程,肠道菌群的失衡会提高婴儿患免疫和代谢疾病的风险,婴儿时期肠道菌群对婴儿及成年后的机体健康均具有积极的生理意义[18]。

表3 粪便菌群发酵非消化糖后其中主要细菌的含量(lg copies/mL)Table 3 The content of bacterial in anaerobic fermentation broth(lg copies/mL)

注:右上角标字母a～g表示同列结果比较的差异显著性,字母不同代表差异显著,即P<0.05;表5同。此外,肠道菌群能够分泌多种酶,参与未消化完全的营养物质的代谢,对婴儿的代谢也有着至关重要的作用[19]。婴儿肠道菌群可利用非消化糖,并产生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等对机体有益的代谢产物,满足菌体自身及婴儿的营养需要[20]。生成代谢产物的种类与含量主要取决于婴儿肠道菌群的组成及菌群可利用的底物种类[21]。

双歧杆菌和乳杆菌是婴儿肠道中具有益生作用的重要微生物,可在肠道中合成多种维生素和氨基酸,增强Fe2+、维生素D和钙的吸收,还可以通过产生乙酸来防止肠道致病菌感染,维持婴儿肠道健康[22]。本研究各实验组中的非消化糖均能促进双歧杆菌和乳酸杆菌和生长。其中,低聚果糖对双歧杆菌的促进作用最强(P<0.05),低聚果糖对乳杆菌生长的促进作用最为显著(P<0.05)。低聚果糖对乳杆菌的促进作用略低于双歧杆菌。周景欣等[23]的研究表明,低聚果糖可促进成人粪便中双歧杆菌和乳杆菌的生长,对前者的促进作用高于后者,发酵后双歧杆菌属和乳杆菌属的含量与未加碳源空白组的比值分别为1.20和1.09。与本研究相比,低聚果糖对成人双歧杆菌和乳杆菌的促进作用强于对一月龄婴儿的菌群的作用,这是由于固体食物的引入后,肠道菌群中会富含更多利用非消化糖的功能的基因编码,有助于菌体对非消化糖的利用[19]。

拟杆菌是在肠道中定植的优势菌群,拟杆菌属也是肠道中降解碳水化合物的主要微生物,可提高食物中营养物质的利用率,在促进肠道发育方面具有重要作用[24]。本研究所有实验组的非消化糖均能促进拟杆菌的生长,其中菊粉组最优。而Hughes等人[11]采用成人粪便体外发酵菊粉时发现,菊粉可显著抑制粪便中拟杆菌的生长。此差异可能由于婴儿与成人源拟杆菌产生的多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲酯酶的含量不同[25]。

肠球菌属和肠杆菌属是肠道内的条件致病菌[26]。本研究发现:仅有低聚半乳糖可减少婴儿粪便中肠杆菌的含量(P<0.05),而其他非消化糖对肠杆菌则无抑制作用。低聚木糖可显著降低一月龄婴儿粪便菌群中肠球菌的含量(P<0.05),这与徐海燕等人[27]通过成人粪便体外发酵低聚木糖的结果一致,表明低聚木糖也可减少成人粪便菌群中肠球菌的含量。梭菌属也是婴儿肠道中数量较多的一类细菌,大部分梭菌属菌株会对机体构成一定的威胁,肠道中梭菌属的含量增多对机体有致癌作用[28]。除低聚木糖组外,本研究各实验组的非消化糖均可减少粪便中梭菌属的含量(P<0.05),其中,低聚果糖组的梭菌属含量最低。Hughes等人[11]研究表明,成人粪便发酵菊粉后,其中梭菌属的含量下降(P>0.05)。可见成人和婴儿粪便菌群体外发酵非消化糖时,梭菌属受到的影响不同,此差异可能由于婴儿时期双歧杆菌属和乳杆菌属为优势菌属含量较多,对梭菌属的增殖起到了竞争抑制的作用[29]。

2.3 有机酸标准品的回归方程

采用液相色谱方法分析有机酸标准品(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸),发现四种酸可以被色谱柱有效分离(图2),保留时间分别为14.5、17.4、20.5和25.3 min。在测定范围内,各标准品均具有较好的线性关系,R2均在0.999以上(表4)。

表4 有机酸标准品的回归方程及决定系数Table 4 Regression equations with correlation coefficientsfor organic acid and coefficient of determination

注:表中x代表标准品的摩尔浓度(mmol/L),y代表的是色谱峰面积值。

图2 四种有机酸的HPLC分析色谱图Fig.2 HPLC analysis chromatogram of four organic acids注:峰1:乳酸;峰2:乙酸;峰3:丙酸;峰4:丁酸。

2.4 五种非消化糖经一月龄婴儿粪便菌群发酵后所产有机酸分析

五种非消化糖经婴儿粪便菌群发酵后,发酵液中乳酸和总短链脂肪酸的含量均显著增多(P<0.05)(表5)。低聚果糖组中乳酸、乙酸及丁酸的含量最高(P<0.05),发酵液中三种有机酸含量分别为23.00、11.10、1.47 mmol/L,且婴儿粪便发酵低聚果糖生成的乳酸及各种短链脂肪酸的总含量最高为40.03 mmol/L;低聚木糖促进丙酸生成的能力最强(P<0.05),发酵液中丙酸含量为5.35 mmol/L。低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉组中乳酸及各种短链脂肪酸的相对含量由高到低均依次为:乳酸、乙酸、丙酸、丁酸;低聚木糖组和聚葡萄糖组中相对含量由高到低均依次为:乙酸、乳酸、丙酸、丁酸。

表5 五种非消化糖经婴儿粪便菌群发酵后短链脂肪酸及乳酸含量(mmol/L)Table 5 Short-chain fatty acids and lactic acid content of five non-digestible polysaccharides fermented by infant fecal(mmol/L)

肠道菌群可通过发酵未消化的碳水化合物产生乳酸各种短链脂肪酸来维持机体健康,其中乙酸、丙酸、丁酸,约占SCFAs总量的90%以上[30]。菌群的代谢过程是肠道菌群与宿主间相互作用最重要的体现,肠道菌群代谢产物的种类和含量与人类机体健康与病理状况之间的直接联系[31]。本研究中五种非消化糖经一月龄婴儿粪便菌群发酵后,发酵液中乳酸和各种短链脂肪酸的含量均显著增多(P<0.05),其中婴儿粪便发酵低聚果糖产生的乳酸及短链脂肪酸的总含量最多。说明一月龄婴儿肠道菌群代谢低聚果糖生成对机体有益的代谢产物的作用最强(P<0.05),同时低聚果糖也可显著促进一月龄婴儿粪便中双歧杆菌和乳杆菌的生长(P<0.05),综合对比五种非消化糖对一月龄婴儿粪便中益生菌群促进作用及生成有益代谢产物的能力,低聚果糖是最适于促进一月龄婴儿肠道健康的非消化糖。此外,五种非消化糖经一月龄婴儿粪便发酵后产生的短链脂肪酸的含量由高到低依次为乙酸、丙酸、丁酸。与本研究相似,Jonathan等人[32]通过成人粪便体外发酵菊粉和低聚果糖,各组发酵液中的短链脂肪酸含量由高到低依次为乙酸、丙酸、丁酸。尽管婴儿和成人的粪便中优势菌群有明显差异,但发酵非消化糖生成代谢产物的趋势明显的相似,这是由于肠道菌群代谢方面的功能冗余的特性[33]。

3 结论

低聚果糖可促进一月龄婴儿粪便菌群中双歧杆菌属、乳杆菌属的生长,抑制梭菌属的增殖,与不含碳源的空白组中菌属含量的比值分别为1.12、1.07、0.92;低聚半乳糖可抑制粪便菌群中肠杆菌的增殖,与空白组中菌属含量的比值为0.98;低聚木糖可降低粪便中肠球菌属的含量,与空白组菌属含量的比值为0.97。低聚果糖经粪便发酵生成的乳酸、乙酸、丁酸均为最高,含量分别为23.00、11.10、1.47 mmol/L,且生成的有机酸总含量也为最高,含量为40.03 mmol/L;低聚木糖组发酵液中丙酸含量最高,含量为5.35 mmol/L。结果表明,综合对比五种非消化糖对一月龄婴儿粪便中益生菌群促进作用及生成有益代谢产物的能力,低聚果糖是最适于促进一月龄婴儿肠道健康的非消化糖。在试图通过非消化糖调节婴儿肠道菌群时,应注意食物因子的选择不同于成人。