动物成肌分化及非编码RNA 调控研究进展

李秦瑾，陈小冬

（华中农业大学动物科学动物医学院，农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，湖北武汉 430070）

随着人们生活水平的不断提高，畜禽集约化养殖的快速发展，提高肌肉的产量和质量成为畜牧工作者的首要任务之一。就畜牧业生产的经济学意义而言，促进成肌分化、提高骨骼肌生长发育及畜禽肌肉产量至关重要。从医学角度来看，目前肌肉肥大或萎缩等疾病的发病率较高，已给人类健康带来了严重危害。本文从动物胚胎成肌分化和调控、个体发育完成后卫星细胞的分化和调控、microRNA 和lncRNA 与肌肉形成关系等方面进行综述，为深入理解畜禽胚胎期肌细胞和个体发育完成后卫星细胞的分化过程及调控机理提供参考,也为提高畜禽肉产量和肉品质提供一定的科学理论指导。

1 胚胎期成肌分化

1.1 胚胎期成肌过程 畜禽的肌肉产量取决于肌纤维数量和截面直径，其中肌纤维数量由胚胎期所决定[1]。动物妊娠初期形成内胚层、中胚层和外胚层3 个胚层。脊椎动物的肌肉分化源于胚胎的中胚层细胞，侧板中胚层形成体节。除了头部部分肌肉来源于近轴头中胚层和脊索前中胚层，四肢、躯干和头部其他肌肉都来源于体节细胞[2]。

1.2 胚胎成肌分化的调控 肌细胞分化是一个由多种功能性因子协同调控的复杂过程。成肌决定因子家族（Myoblast Determination Genes Family，MyoD family）包含4 个成员，即生肌调控因子4（Myogenic Regulatory Factor 4，MRF4）、生肌决定因子（Myoblast Determination Protein，MyoD）、肌细胞生成素（Myogenin，MyoG）和生肌因子5（Myogenic factor 5，Myf5），该家族成员也称为生肌调控因子（Myogenic Regulatory Factors，MRFs）[3]，共同参与整个成肌分化和肌纤维形成的过程，其中MyoD 和Myf5主要决定成肌细胞的形成，MyoG 和MRF4 则主要决定肌细胞分化和肌管/肌纤维形成（图1）。成对的框转录因子3（The Paired Box Transcription Factor 3，PAX3）、成对的框转录因子7（The Paired Box Transcription Factor 7，PAX7）和原始肌源细胞标志因子Myf5 在生皮肌节细胞中表达[4]，其中PAX3 和PAX7 作用于下游的MRFs，PAX3和PAX7的表达是胚胎细胞向肌祖细胞分化的标志[5]，而Myf5 可平行于PAX3、PAX7 影响下游MyoD的表达。小鼠缺失MyoD或Myf5不影响肌肉的形成，只有当两者同时缺失时才会导致肌肉缺失[6]。这些因子在胚胎期成肌分化的不同时期表达，贯穿了成肌分化的整个过程，并对肌细胞分化和肌纤维形成发挥着重要的调控作用。

图1 肌管发育从胚胎到成熟过程中重要转录因子的表达时间[7]

除了以上经典的成肌分化的调节因子，近些年来的研究还发现许多新的参与调控成肌分化的因子。蛋白组学分析发现，神经损伤诱导蛋白1（Ninjurin1）在主动脉狭窄患者的肥厚性心脏中表达增加，这是一种细胞表面的跨膜蛋白，参与细胞黏附和神经修复，Ninjurin1 能通过N-糖基化的Ninjurin1-24 介导促进横纹肌的生长和分化[8]。作为一种转录辅助因子，Vgll3（Vestigial-like factor 3）能够与TAED 家族的转录因子结合下调Hippo 通路的负反馈调节，进而影响骨骼肌的生成[9]。有研究报道，甲基化修饰也对成肌分化有重要影响，早期肌源性基因转录起始位点的去甲基化和肌源性基因的高甲基化是引起小型猪肌源性基因早期表达的主要原因，其中DNA 去甲基化酶Tet1 参与肌源蛋白启动子的去甲基化，促进小鼠成肌细胞（C2C12）的永生化和猪胚胎肌原细胞的分化[10]。骨骼肌中含有大小不同、收缩速度不一的异质肌纤维，其中Ⅱb 型肌纤维最大、收缩速度最快。研究发现一种非组蛋白甲基转移酶Mettl21e 能够对泛素-蛋白酶系统的关键因子含缬氨酸蛋白（Vcp/p97）甲基化，从而抑制蛋白酶体介导的降解过程来维持肌纤维的大小[11]。

1.3 胚胎期成肌分化的信号通路 胚胎期成肌分化受到周围环境信号通路调节，如外胚层和神经管分泌的Wnt家族蛋白（Wingless and INT-1 proteins，Wnts）、神经管和脊索释放的音猬因子（Sonic hedgehog，Shh）以及侧板中胚层生成的骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs）[12]。

Wnt 家族蛋白在生皮肌节和肌节的形成以及肌发生过程中起着重要的作用。Wnt1 突变缺失的小鼠会引起生皮肌节部分减少并且下调PAX3 和 Myf5 的表达量[13]。在体节中，Wnt1 与受体Fzd1/Fzd6 结合激活β-catenin 途径提高Myf5的表达，而Wnt7a 与受体Fzd7 结合后通过激活蛋白激酶C（PKC）促进MyoD的表达。β-catenin 能促进MyoD 与肌源性位点的结合从而广泛协调肌源性基因网络，β-catenin-TCF/LEF 复合物可通过负反馈调节控制β-catenin 水平，从而防止早熟或过度的成肌细胞融合[14]。

Shh 蛋白是一种广泛表达的锌指转录因子，在生皮肌节细胞转变为肌节细胞过程中必不可少，生皮肌节细胞转化为肌节细胞后会高量表达MyoD/Myf5，但低水平表达PAX3/7。T 细胞因子（T Cell Factor，TCF）和Hedgehog 信号通路核转录因子GLI（Glioma-Associated Oncogene Homoglog）在Myf5基因上有结合位点，因此Shh 才可能与Wnt 协同地激活Myf5表达[15]。

BMPs 能够抑制某些成肌分化基因的表达，如Bmp4 可延迟Myf5和MyoD的表达，同时保持PAX3的表达，从而使肌祖细胞维持一种不分化状态[16]。这表明在启动肌细胞分化之前，BMPs 对肌祖细胞的增殖有重要作用。

在成肌分化过程中Notch 信号通路作也有重要意义。生皮肌节细胞上的Jagged 配体短暂地与相邻细胞的Delta1 接触，从而激活Notch 信号通路，激活的Notch 信号与RPB-J 蛋白以及转录抑制因子Hes1 结合进而下调MyoD表达[17]。

2 卫星细胞分化与调控

胚胎发育完全后的个体在疾病或受伤时需要卫星细胞大量地再生肌肉。除了头部某些肌肉外，成年个体卫星细胞可由体节中能够表达PAX3 和PAX7 的细胞转化而来。卫星干细胞激活后可通过有丝分裂增殖来增加细胞数目，这些卫星干细胞其中一部分维持原有的干性，另一部分则通过上调MyoD表达诱导定向成肌分化[18]。MyoD 诱导成肌细胞进入细胞增殖周期，并刺激成肌细胞表达MRF4、MyoG 等肌细胞特异性因子。随后PAX7 表达量下调，成肌细胞退出增殖周期并开始与其他成肌细胞融合形成肌管[19]。

卫星细胞数目保持常数才能使肌细胞维持再生能力。目前有2 种保持卫星细胞数的设想模式：一是随机模式即卫星细胞分裂成2 个相同的子代细胞，其中一个维持卫星细胞干性特质，另一个分化为成肌细胞；二是不对称分裂模式即卫星细胞产生2 个不同的子代细胞，DNA 共分离进入子细胞诱导分化，原来的细胞保持不变[20]。研究者利用Myf5-Cre-stop-flox-YFP 报告系统证明了卫星细胞是通过不对称分裂的方式保持自我更新和分化[16]。

卫星干细胞的静息、激活、自我更新和分化等过程受到所处环境的许多信号调控[16]。在成体肌肉中，卫星细胞通常处于静息状态不进行有丝分裂，M-钙粘蛋白是静息卫星细胞和活化生肌前体细胞的标志物。卫星细胞在静息状态下表达肌生成抑制蛋白（Myostatin），这种负调节因子既抑制卫星细胞增殖又抑制其分化[21]。卫星细胞受刺激后会引起NO 的合成，进而引发肝细胞生长因子（HGF）的释放，然后由肝细胞生长因子的受体c-Met 介导卫星细胞的激活[22]。卫星细胞激活后会启动增殖和分化程序，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来源于细胞外基质，能够结合受体促进卫星细胞的增殖并抑制其分化[23]；胰岛素样生长因子1（IGF1）利用多条信号通路，如3-羟基-磷酸肌醇激酶（PI-3K）和有丝分裂原激酶（MAPK），促进卫星细胞的增殖与分化。Notch 和Wnt 信号通路都参与卫星细胞的增殖和分化，当Notch 信号通路被激活时，GSK3β被磷酸化并处于激活状态，Wnt 信号通路被抑制，PAX3 的表达量增加从而促进卫星细胞的增殖；卫星细胞分化的起始是由于Notch 与Wnt 信号通路的转化和过渡，骨骼肌内Wnt 信号直接作用于卫星细胞使卫星细胞由增殖向分化阶段转变[24]。

3 MicroRNAs 与肌肉发生

MicroRNAs（miRNAs）是一种高度保守的非编码小RNA。研究发现，miRNAs 广泛作用于控制细胞成肌分化的关键基因，对成肌分化产生重要影响。根据表达的特异性不同，miRNAs 可分为肌肉组织特异性的miRNAs 和非肌肉组织特异性两类。各种miRNA 对成肌分化调控作用见表1。miRNAs 不仅参与调节骨骼肌和心肌的发育、生长、再生以及成肌细胞的增殖和分化，并可能与多种肌肉相关的疾病（如进行性肌营养不良、心肌梗死、心肌肥大等）有关。

4 LncRNA 与肌肉发育

长链非编码RNA（Long non-coding RNAs，lncRNAs）广泛存在于哺乳动物中。LncRNAs 具有多种生物学功，其中在肌肉发育过程中也具有重要的调控作用，可通过靶向肌细胞分化和骨骼肌发育的关键调控因子参与调控成肌分化的各个环节。

LncRNAs 是调控肌细胞分化的重要调控因子。作为哺乳动物中第一个被发现的lncRNA，H19 一方面能顺式调控Igf2 进而促进骨骼肌卫星细胞的肌源性发生和分化，另一方面可以反式调控靶基因，包括海绵化let-7、miR-106 或miR-29 介导心肌细胞的增殖和葡萄糖摄取以及肌腱修复，并通过结合MBD1 修饰染色质促进胚胎发育和肌肉再生，因此其在肌肉中的功能引起了广泛关注[31]。MyoD1基因上游30 kb 处能够转录出来lncMyoD。MyoD 能够结合到lncMyoD 启动子上，进而增强lncMyoD 与IMP2 的结合，进一步促进周期蛋白的表达使细胞处于细胞周期来间接抑制成肌细胞的分化[32]。

表1 miRNAs 对成肌分化调控作用

目前lncRNA 调控骨骼肌生长发育机制的研究还处于初始阶段。有研究表明，linc-RAM（linc-RNA Activator of Myogenesis）通过直接结合MyoD 调控肌源性基因的表达，进而促进MyoD-Baf60c-Brg1 复合物在靶基因调控元件上的组装来激活骨骼肌的生成[33]。lncRNA Irm 通过直接与MEF2D 结合促进MyoD/MEF2D 在靶基因调控元件上的组装从而调控肌源性基因的表达[34]。Zhu 等[35]研究发现，LncRNA lnc-mg 调节骨骼肌发育，它可通过作为microRNA-125b 的竞争内源性RNA（ceRNA），控制胰岛素样生长因子2 的蛋白丰度，促进骨骼肌生成。研究发现肌源蛋白启动子相关的lncRNA Myoparr 能够抑制肌肉萎缩的抑制因子GDF5，并且下调BMP 信号通路进而促进肌肉萎缩[36]。lncRNA Kcnqlot1 能通过促进H3K27me3积累到MyoD 结合区来控制肌细胞中p57的表达进而调控成肌分化[37]。Li 等[38]新鉴定出一种lncRNA 能通过海绵miR-15 家族来激活IGF1-PI3K/AKT 通路，从而促进骨骼肌肌肉生成和控制肌肉萎缩。

5 总结与展望

近年来，随着各种研究技术手段的发展，胚胎干细胞成肌分化及骨骼肌发育方面取得了一系列的重要进展，控制成肌分化和肌肉发育的重要基因和调控途径也相继揭示。通过转录组测序分析（RNA-seq）进一步鉴定出大批调控干细胞成肌分化和骨骼肌生成相关的miRNAs 和lncRNAs，并对它们的功能及调控靶点进行了验证，然而大部分研究集中在啮齿模式动物上，大量数据在畜禽动物上尚未得到验证。目前，阻碍畜禽胚胎干细胞成肌分化和骨骼肌发育研究取得重大突破性进展因素主要有3 个方面：一是对畜禽骨骼肌发育的特点及分子机制的理解不够；二是对畜禽不同品系骨骼肌发育差异的表观遗传学解析不够；三是对畜禽胚胎干细胞研究的技术还不够成熟。突破这些问题将有利于畜禽肉品质的改良及我国畜禽资源的有效利用。因此，未来几年，可借助于干细胞技术、各种组学研究技术、表观遗传学及miRNAs 和lncRNAs 等手段，通过比较生物学研究策略，探究和挖掘控制畜禽胚胎干细胞成肌分化、骨骼肌发育及骨骼肌损伤修复等相关的重要功能基因及调控机制。