兰坪乌骨绵羊屠宰、乌质性状及基因克隆的研究进展

刘兴能，彭超超，苑梦雅，席冬梅，姜祥梦，王利平，邓卫东*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明 650201；3.新乡学院生命科学技术学院，河南新乡 453000）

兰坪乌骨绵羊于2001 年由云南农业大学毛华明教授首次发现，兰坪乌骨绵羊的乌骨乌肉性状并非铅锌（Pb、Zn）中毒，而是由高含量的黑色素沉积（与乌骨鸡一样）所致，且乌质性状可遗传，经检索后确认兰坪乌骨绵羊是世界唯一一种具有乌骨乌肉特征的哺乳类动物[1]，2006 年被正式命名为“兰坪乌骨绵羊”，其体内的黑色素可能具有药用和保健价值，被誉为畜牧业的“国宝”[2]。2009 年通过农业部畜禽遗传资源委员会认定，兰坪乌骨绵羊列入《中国珍稀动物名录》和《世界珍稀动物名录》，2011 年收录于《中国畜禽遗传资源志· 羊志》。本文系统总结了兰坪乌骨绵羊的研究概况，并分析了影响兰坪乌骨绵羊乌质性状的因素，为乌骨绵羊的研究与种质资源保护提供理论依据。

1 兰坪乌骨绵羊的外貌特征、屠宰性状及肉品质

1.1 兰坪乌骨绵羊的外貌特征 兰坪乌骨绵羊毛色有纯白、纯黑、杂色3 种，头和四肢上的被毛短细，其他部位的被毛粗密，一般一年可剪2 次毛；多数无角（约占90%），角呈半螺旋状向后，耳朵多数大而下垂，眼结膜呈浅墨色，牙齿、牙龈呈青绿透明；颈部短而无皱褶，鬐甲小低，背平直，胸宽深，腹大且不下垂，四肢粗短有力，前肢关节呈青紫色，肛门处呈乌黑色，尾端呈锥形。成年乌骨绵羊平均体重36～58 kg，体高61～68 cm，胸围82～92 cm，尾长18～19 cm。其体格大小、毛色等外貌与兰坪本地绵羊相似，故粗看难以分辨兰坪乌骨绵羊与兰坪本地绵羊，但生产中可以通过仔细观察犬齿、牙龈、眼结膜、关节、腋窝、肛门处6 个部位的颜色进行感官区分[1]。

1.2 兰坪乌骨绵羊的屠宰性状及肉品质 目前兰坪乌骨绵羊屠宰性能及肉品质试验报道十分有限，且试验结果报道并不一致（表1、2）。在兰坪乌骨绵羊的屠宰性能方面，陈圆等[3]试验表明，兰坪乌骨绵羊与兰坪本地普通绵羊相比，宰前活重、头、骨、净肉重、皮、胴体重兰坪乌骨绵羊均较重（差异显著），这一结果与范江平等[4]研究结果相悖。在兰坪乌骨绵羊肉品质方面，陈圆等[3]研究发现，兰坪乌骨绵羊背最长肌的粗蛋白质含量较兰坪普通绵羊背最长肌显著高2.56%、粗脂肪低5.78%；而范江平等[4]试验表明，兰坪乌骨绵羊背最长肌的粗灰分中磷含量比兰坪普通绵羊高0.13%。此外，常星耀等[5]随机选用3 只1 岁、3 只1.5 岁兰坪乌骨绵羊的背最长肌、股二头肌进行羊肉营养成分分析，结果表明兰坪乌骨绵羊羊肉粗蛋白质含量比河南小尾寒羊高1.2%、粗脂肪含量比河南小尾寒羊低0.14%；兰坪乌骨绵羊氨基酸总含量（18.71%）比河南小尾寒羊高0.29%，其中兰坪乌骨绵羊含人体必需氨基酸中的色氨酸（Ser）、赖氨酸（Lys）含量分别为0.80、1.66 mg/100g；其他的营养成分（脂肪酸、不饱和脂肪酸、多种矿物质元素）含量丰富。

兰坪乌骨绵羊与兰坪本地普通绵羊屠宰性能及常规成分存在差异，其一是由于兰坪乌骨绵羊刚发现时数量较少（201 只），没有足够的样本容量；其二是由于发现其价值后价格昂贵，试验样本不能满足试验需要。

2 兰坪乌骨绵羊的血液生理生化指标

目前，国内期刊关于兰坪乌骨绵羊血液生理生化指标的研究文献仅有1 篇，即邓卫东等[6]对40 只兰坪乌骨绵羊、23 只兰坪本地普通绵羊、21 只罗姆尼羊进行血液生化指标的研究，结果显示，兰坪乌骨绵羊血液中超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力、血浆比色的相关系数均高于非乌骨绵羊；与非乌骨绵羊相比，兰坪乌骨绵羊肝代谢功能旺盛，且有较强的自身免疫功能。可知，与非乌骨绵羊相比，乌骨绵羊具有较强的免疫力，肝代谢旺盛，解毒能力强。

3 兰坪乌骨绵羊的乌质性状

3.1 黑色素概况 Berzelius 于1840 年首次使用黑色素（Melanin）这一名称，黑色素通常被定义为一类由酚类或吲哚类物质经过一系列化学氧化反应形成的生物色素，因由许多不同类型的单体以C-C 键结合而成，使得黑色素分子具有不溶于水与有机溶剂、抗浓酸等特性[7]。黑色素是在黑色素细胞内的黑小体上形成的。哺乳动物体内的黑色素主要分为含硫的脱黑色素（Phaeomelanin）和不含硫的真黑色素（Eumelanin），前者呈黄色或微红棕色，后者呈黑色或棕色。酪氨酸是形成黑色素的主要原料，酪氨酸酶系是酪氨酸转变为黑色素的主要限速酶。酪氨酸在酪氨酸酶的作用下经过一系列氧化反应产生黑色素，即酪氨酸—多巴—多巴醌—多巴色素—二羟基吲哚—酮式吲哚—黑色素。

目前，虽然黑色素的结构尚未完全研究清楚，但基本结构是一些共价交联的吲哚环。黑色素主要有以下4个重要的生物学功能[8]：①黑色素在蛋白质交联会的过程中提供机械力保护蛋白质不被降解；②黑色素的形成过程中正醌的产生对进化有重要意义，能使一些亲核基团（-SH、-NH2）获得抗生素特性；③黑色素是一种光保护色素；④黑色素与许多神经系统疾病密切相关，还能抗诱病[9-10]。

3.2 兰坪乌骨绵羊的乌质性状

3.2.1 兰坪乌骨绵羊乌质性状定性与定量研究 兰坪乌骨绵羊的乌质性状经本课题组多年的研究可以确定为高含量的黑色素沉积所致。杨舒黎等[11]对兰坪乌骨绵羊黑色素进行红外光谱分析发现，与乌骨鸡真黑色素的吸收峰、分子结构及IR 光谱总体特征相似[12-14]，说明兰坪乌骨绵羊的黑色素也为真黑色素。

兰坪乌骨绵羊不同器官及不同年龄阶段的黑色素含量不同。杨舒黎等[1]研究结果显示，兰坪乌骨绵羊的黑色素存在着时（年龄）空（组织器官）性差异，即随着年龄（2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 岁）增加组织器官中的黑色素含量也增加，各组织器官中肝脏的黑色素含量最高，骨骼最低。这结果杨舒黎等[11]、与Muroya 等[15]研究结果一致。此外，根据试验研究结果[1,6]推测，兰坪乌骨绵羊较当地普通绵羊的肝代谢旺盛、解毒能力强，可能与黑色素在肝脏上含量最高有关，黑色素可能具有解毒的医用价值，这一推测还需要进一步研究验证。

表1 乌骨绵羊与兰坪本地绵羊屠宰性能的比较

表2 乌骨绵羊与兰坪本地绵羊羊肉常规成分的比较 %

3.2.2 兰坪乌骨绵羊乌质性状相关生理生化特性 王鑫玉[16]对年龄基本相同的105 只乌骨绵羊、108 只兰坪本地绵羊和83 只罗姆尼羊开展了乌骨绵羊乌质性状的生理生化特性研究，结果显示，与兰坪普通绵羊和罗姆尼羊相比，兰坪乌骨绵羊的血浆比色（0.09、0.06、0.06 OD/mL）、酪氨酸酶活性（359.32、198.54L、123.66 IU/mL）、真黑色素、总黑色素含量（0.97、0.49、0.47 OD/mL）、真黑色素/总黑色素比例（0.27、0.19、0.10）均有显著差异，但兰坪乌骨绵羊和兰坪普通绵羊血浆中脱黑色素含量（0.21、0.21 OD/mL）没有显著差异。由此可以得出：①高活力的酪氨酸酶是兰坪乌骨绵羊乌质性状形成的限速酶，是乌质性状形成的主要影响因素；②兰坪乌骨绵羊的黑色素主要是真黑色素，这与杨舒黎等[11]研究结果基本一致，再次表明兰坪乌骨绵羊的乌质性状是由真黑色素含量沉积所致。

3.3 兰坪乌骨绵羊乌质性状基因 目前乌骨绵羊具有乌骨乌肉性状的黑色素基因是研究乌骨绵羊的一个重要方向，本课题组已经进行了多个影响黑色素合成代谢的基因研究。

杨舒黎[17]选用了40 只兰坪乌骨绵羊、23 只兰坪本地绵羊、21 只寻甸罗姆尼羊进行乌质性状与TYR基因多态性相关分析，结果表明TYR的突变与乌质性状有关基因紧密相连，与邓卫东等[3]的研究结果一致，即乌骨绵羊TYR含量决定黑色素在肌肉上的沉积，从而形成乌骨绵羊的乌质性状。另外，还与众多对TYR家族进一步研究的结果一致（表3），即TYR基因家族不是乌骨绵羊控制乌质性状的主效应基因。

舒文等[19]研究显示，与兰坪普通绵羊相比，兰坪乌骨绵羊黑皮质素受体1（MC1R）等位基因的频率差异不显著；与罗姆尼羊相比，兰坪乌骨绵羊MC1R等位基因的频率差异显著，推测MC1R不是控制乌质性状的主效应基因，这一结果与Deng 等[20]研究结论一致。

总结现有11 篇研究影响黑色素合成代谢主要因素的报道可以得出以下结论：①乌骨绵羊中TYR基因是影响黑色素沉积的主要原因，TYR酶活性对黑色素有限制作用；②RAB基因家族的表达丰度可能与乌质性状存在关联；③CREB、GST可能是乌骨绵羊乌质性状的候选基因，但需要进一步的科学验证；④就目前的报道来看，SLC基因家族与黑色素的形成没有显著的关联。

目前，控制乌骨绵羊乌质性状的主效应基因尚未确定，大量研究证实控制黑色素的因素包括神经、激素或两者综合影响，但对黑色素集中扩散的机制尚不完全清楚，仍然处在探索与推测阶段，这就说明对兰坪乌骨绵羊乌质性状致因基因的研究仍任重而道远。

表3 兰坪乌骨绵羊黑色素合成代谢主要影响因素的探索研究进展

4 兰坪乌骨绵羊基因克隆

Deng 等[29]最早对兰坪乌骨绵羊的TYR、MC1R和Agouti 信号蛋白基因（ASIP）进行克隆测定后与普通绵羊相应基因的序列对比进行了初步研究,结果表明兰坪乌骨绵羊的TYR外显子1 与兰坪普通绵羊相比有2 个同义突变，分别为DQ530058 和DQ530059（突变点192G>C 和462C>T）；兰坪乌骨绵羊较兰坪普通绵羊的MC1R 中同源突变是DQ530056 和DQ530057（突变点12A>G 和144G>C）；兰坪乌骨绵羊血液的ASIP 序列（DQ531713）和普通绵羊血液的ASIP 序列（DQ531714）无显著差异。

赵素梅等[30]从乌骨绵羊的肌肉组织全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）获得了与任何绵羊及山羊的基因核苷酸序列不同的3 个全新基因，即ATP 合成酶亚基O（ATP50）、NADH 脱氢酶1α亚基（NDUFA12）、泛醇-细胞色素C 还原酶铰链蛋白（UQCRH），结果表明乌骨绵羊的以上3 个基因和蛋白质序列与牛的遗传关系较近；ATP50、UQCRH 蛋白质结构可以被模拟；不同组织表达量不同。

Li 等[31]通过收集6 只成年乌骨绵羊的腿部肌肉、肾脏、皮肤、背最长肌、脾脏、心脏和肝脏等组织分离磷酸酯酶基因（PSPH）、重组人U2 小核核糖核蛋白肽A（SNRPA1）和重组人原肌球蛋白-1（TPM1）基因，然后将乌骨绵羊PSPH、SNRPA1和TPM1基因的PCR 产物克隆到PMD18-T 载体中并双向测序，分析表明乌骨绵羊PSPH、SNRPA1和TPM1基因与非乌骨绵羊基因不同源；乌骨绵羊PSPH、SNRPA1和TPM1与牛PSPH、SNRPA1和TPM1具有密切的亲缘关系；3种基因在不同组织中表达程度不一。该文献是乌骨绵羊的PSPH、SNRPA1和TPM1基因克隆进行必要的功能分析和组织表达谱的第1 篇报告。

李隐侠等[32]采取了云南乌骨绵羊耳组织样（取自江苏省农业科学院畜牧研究所羊场），利用相关PCR等技术获得乌骨绵羊成纤维细胞核受体Nr5a2 抗体（NR5A2）基因的外显子序列并对其进行分析，结果表明乌骨绵羊蛋白编码氨基酸序列同源性与牛和湖羊较高，分别为89.66%、99.41%，乌骨绵羊的NR5A2 蛋白不稳定，不存在信号肽，不是分泌蛋白，未发现跨膜区，是非跨膜蛋白；乌骨绵羊NR5A2基因编码区核苷酸序列与牛同源性有85.51%，与湖羊同源性较高为99.87%，有C1069A、C1419T 和G1485A 3 个突变位点，且C1069A 能引起相应氨基酸的改变。

Hesham 等[33]对兰坪乌骨绵羊、兰坪普通绵羊耳样品内皮素3（EDN3）基因分子进行克隆和鉴定，结果显示EDN3不是色素沉着过度的原因，但可能在兰坪乌骨绵羊的免疫和排泄系统中起关键作用。

综上可知，兰坪乌骨绵羊基因的亲缘关系与牛较近，克隆了乌骨绵羊5 个基因并发现了一些多态位点，这对乌骨绵羊的遗传与育种具有初步指导作用。

5 兰坪乌骨绵羊的保护开发与展望

自兰坪乌骨绵羊被发现以来，因其集科研、食用、药用于一身，具有重要经济价值，受到众多专家学者及市场青睐，对兰坪乌骨绵羊的保护和开发亟需完善保种方案。由此提出以下建议：①在开发的同时注意保种，由区域化推向全国化，杜绝杂乱散养，建立保护区与核心区；②注重选育原则与方法，配种以本交为主，人工授精为辅；③加强保护制度、研究力度；④进一步针对乌质性状影响因素及形成机制开展更深入研究，寻找出控制乌质性状的致因基因，为兰坪乌骨绵羊的保护、开发和利用提供科学的理论依据。