国外引进辣椒遗传多样性的ISSR研究

徐小万，夏碧波,，宫 超，王恒明，李 颖，吴智明

（1广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广州510640；2仲恺农业工程学院园艺园林学院，广州510225）

0 引言

辣椒(Capsicumspp.)在蔬菜作物中地位颇高，享誉国际，不仅具有世界性的种植范围，也受到全球消费者的喜爱，可谓家庭必备[1]。辣椒属于茄科(Solanaceae)茄亚族(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)一年生或多年生植物，灌木、半灌木，多分枝。辣椒属大约有25个种，国际植物遗传资源委员会确定其中5个为栽培种，它们是C.annuum、C.frutescens、C.chinense、C.baccatum、C.pubescens[2]。辣椒主要分布在南美洲，栽培种世界各地均有分布。

世界各国非常重视辣椒育种研究，常规育种已经取得了巨大成就，选育了一大批优良品种应用于生产，产生了较好的经济效益和社会效益。世界各辣椒育种团队对辣椒种质资源开展了大量研究，这些研究成果对辣椒育种和产量的提高起到很重要的作用。尽管各辣椒科研团队收集引进或创制了较丰富的辣椒种质资源，但是大部分研究工作都停留在辣椒种质资源形态描述阶段[3-4]。分子标记是继形态标记、细胞学标记和生化标记之后，近20 年来，广泛应用的一种新的标记方法。与以往的遗传标记相比，分子标记有许多特殊的优点，如无表型效益、不受环境限制和影响等。分子标记已广泛用于种质资源遗传多样性研究。

利用分子标记技术开展了部分辣椒种质资源分析研究工作，如基于DNA 分子杂交的分子标记RFLP[5]，基于 PCR 反应的分子标记 RAPD[6-11]、SSR[12-13]、ISSR[14-17]、SRAP[12-13,18]，基于 PCR 与限制性酶切结合的检测方法AFLP[19]。上述利用分子标记分析辣椒种质资源相关研究取得了较好成效，但辣椒种质资源遗传多样性分析相对滞后于辣椒种质资源的开发与利用。

国外辣椒种质与国内资源亲缘关系相对较远，遗传差异也较大，国外种质资源引进可拓展中国辣椒遗传背景，增加资源储备，为保证国内辣椒育种及产业发展奠定物质基础。笔者以国外引进的30 份辣椒种质为试材[20]，采用ISSR 分子标记进行种质的聚类分析，为准确鉴定辣椒种质和科学利用辣椒材料提供相关理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

30份辣椒种质资源均引自马来西亚，其中编号为156、159、162、163、168、181、182 和198 的8 份材料田间表现抗疫病和青枯病。

1.2 辣椒基因组DNA的提取

参照CTAB法提取30份辣椒材料基因组DNA[17]，试验所用的缓冲液、dNTP 和Taq DNA 聚合酶均购自上海Sangon公司。

1.3 ISSR引物和扩增反应体系

根据SSR 序列特点设计的一套固定的ISSR 引物。本研究采用的是加拿大哥伦比亚大学(University of British Columbia Biotechnology, UBC)公布的ISSR引物，共计96条。从预备试验中筛选出8条引物，这8条引物能扩增出清晰，重复性、稳定性及多态性均较好的PCR 产物。ISSR-PCR 反应体系参照徐小万等[17]的方法。

1.4 数据统计与处理

选择性扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，利用ABI377测序仪保存电泳胶图。利用GENESCAN软件分析保存的胶图，每2个碱基读一次数，Marker片段范围为50～1000 bp，共读取475 个数。一个泳道为一个样品，每个泳道加入的荧光分子量标准ROX-1000，50～1000 bp 共23 条带。利用胶图中保存的图像信号直接生成分子量矩阵(Matrix)，而后采用BINTHERE软件把生成的分子量矩阵转变为“0”、“1”二维矩阵，无带记为“0”，有带记为“1”[21]。

用NTSYSpc-2.10e软件进行数据分析。聚类图参照下列步骤进行：对原始矩阵用SimQual程序求DICE相似系数矩阵，并获得相似系数矩阵，用SHAN程序中的UPGMA 方法进行聚类分析，并通过Tree plot 模块生成聚类图。主坐标二维图或三维图按照下列步骤进行：利用Qualitative Data程序生成30份国外引进辣椒种质的遗传相似性系数矩阵，接着生成Dim center 数据矩阵，而后采用Eigen 程序，最后在Mtrix plot 和Mod3D plot选项中生成主坐标二维图和三维图。

2 结果与分析

2.1 DNA提取与ISSR引物分析

采用改良的CTAB法提取辣椒叶片DNA，经凝胶电泳检测，各DNA 带型均整齐一致，基本无降解现象。将 30 个样的 DNA 浓度均调整到 40 ng/μL 进行ISSR-PCR反应扩增。从96个ISSR引物中筛选出的8个引物，在30 个辣椒样品中共产生1781 条带（表1），多样性条带共计1389 条，多样性位点百分率77.99%。上述分析说明，试验检测的样品具有较高的遗传多样性。8 条ISSR 引物的平均多元率(multiplex ration)为222条带/引物，多样带多元率为173条带/引物。

8 条ISSR 引物在30 个辣椒样品中扩增片段的大小主要在200～650 bp 之间。但不同的引物能扩增出来的条带数也是不同的，其中引物编号835和886扩增出的条带数较多，分别为263 和250 条；而引物编号807 和840 扩增出的条带数较少，分别为148 和157条。从表1 分析可知，8 条引物在30 份试验样品间扩增出来的条带的多态率也是不同的，引物编号807 的条带多态率最高为86.54%，而引物编号835 和886 引物的多态率较低，分别为73.00%和72.40%。由此可见辣椒种质资源存在极为丰富的遗传多样性，利用分子标记可以检测辣椒种质间的亲缘关系。

图1 为引物编号807 和808 分别在编号为156、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167、168、169、171、172、173、174、175、177、178、180、181、182、183、184、190、191、192、198和199的30个辣椒材料中的ISSR-PCR扩增电泳图谱。

表1 30份辣椒资源8条ISSR引物PCR扩增位点的多样性

2.2 聚类分析

图2 表明，30 个国外引进的辣椒资源的遗传相似性系数在0.70～0.87 之间。从UPGMA 法聚类分析图可知（图2），遗传相似性系数在约0.724(L1)时，30份国外引进的辣椒材料分为3个大类。第1类是最大的一个类群，共19 份辣椒材料，编号分别是156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173、158 和 191；第 2 类共 10 份辣椒种质资源，编号分别是157、165、169、171、172、164、160、166、177 和175；第3 类只有编号为167 的辣椒资源。若以遗传相似性系数0.771(L2)为界，这30份国外引进的辣椒种质可分为4亚类。第Ⅰ亚类共18份辣椒材料，编号分别为156、159、163、168、178、174、183、184、181、182、190、180、192、198、199、162、173和158；第Ⅱ亚类只有编号为191 的辣椒种质；第Ⅲ亚类编号分别是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亚类只有编号为167的辣椒资源。

2.3 辣椒种质资源亲缘关系的主坐标分析

对30份国外引进的辣椒种质资源的ISSR标记的原始矩阵进行主坐标分析；30份国外引进的辣椒材料的主坐标二维图和三维图具体如图3～4。

30 份国外引进的辣椒材料在主坐标二维图排序中分为4 类（图3）。第Ⅰ类共18 份辣椒材料，编号分别为156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180；第Ⅱ类只有编号为191 的辣椒种质；第Ⅲ类编号分别是157、165、169、171、172、164、160、166、177和175；第Ⅳ亚类只有编号为167的辣椒资源。

图1 引物807和808在30个辣椒材料中的ISSR-PCR扩增电泳图谱

图2 30个辣椒材料的ISSR聚类分析图

图3 30个辣椒材料的ISSR标记的主坐标二维散点图

图4 30个辣椒材料的ISSR标记的主坐标三维散点图

30 份国外引进辣椒种质资源在主坐标三维图排序中分为3 类。第1 大类共18 份辣椒材料，编号分别为 156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184和180，这与二维图分类一致；第2 大类共11 份辣椒材料，编号分别是157、165、169、171、172、164、160、166、177、175和167；第3大类只有编号为191的辣椒种质资源。

通过对图2～4 的结果比较分析可知，主坐标分析对30个国外引进的辣椒种质资源进行聚类和UPMGA系统聚类结果大体一致，部分材料略有差异；主坐标分析能直观、多层次和整体地反映出辣椒种质资源的亲缘关系。

3 讨论

3.1 ISSR研究辣椒的遗传多样性

本研究从哥伦比亚大学公布的96条ISSR引物中筛选到8 条稳定性好的多样性引物，这8 条ISSR 引物平均扩增条带数为222条，平均多态条带数为173条。已有研究者们应用ISSR 标记开展辣椒种质遗传多样性分析，均取得了较好的成效[14-17,22-24]。学者们对辣椒种质资源的遗传多样性已有大量研究[13]，对国外引进的辣椒种质资源的遗传多样性研究却相对比较少[25]。笔者应用8 条ISSR 标记对30 份国外引进的辣椒种质资源进行了遗传多样性分析，从构建的遗传相似系数和UPGMA聚类图及主坐标分析可知，ISSR标记基本上可以把30份国外引进的辣椒种质分为2个大类，其中编号分别为156、158、163、159、198、168、190、199、182、178、174、158、192、181、183、173、162、184 和180这18 份材料为一个大类，为一年生辣椒(C.annuum)；另外的12份材料为另一个大类，可能包括其他的辣椒栽培种。由上述分析可知，ISSR分子标记在研究辣椒种质资源鉴定分类方面是一种可行的分子标记。

3.2 形态指标与ISSR标记聚类分析的比较

通过对比形态学性状[20]和ISSR分子标记2种聚类结果分析可知，形态学标记与ISSR标记的聚类结果绝大部分相符，基本上能把一年生辣椒聚为一类，而其他的栽培种聚为另一类，由此说明形态学聚类与ISSR分子标记聚类具有一定的一致性。但在形态学性状聚类分析时，编号为191的辣椒种质资源归为中华辣椒(C.chinense)，而在利用ISSR 分子标记聚类分析时，编号为191 的辣椒种质资源却归为一年生辣椒(C.annuum)，这可能是本研究选用的ISSR引物太少，下一步需加大ISSR引物数量。2种方法从不同的水平和角度进行聚类，不能相互替换，只能互相结合和互相印证，以更全面阐明分析结果，更好分析辣椒种质资源的亲缘关系。