前列腺癌患者血清miR-221水平与临床特征的关系及诊断价值

关胜 曹林升 徐皖江 蔡万松 孟繁华 叶李银

前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤。随着人类发展指数的上升和社会老龄化加剧，我国前列腺癌发病率逐年上升[1]。前列腺癌起病隐匿，早期缺乏特异性的临床表现，多数患者就诊时已是中晚期。因此，早期发现、早期治疗至关重要[2]。前列腺特异抗原（PSA）是目前临床上应用最广泛的前列腺癌生物标志物[3]。但它作为前列腺癌的生物标志物尚存在不足，如本身缺乏足够的特异性，早期诊断前列腺癌的灵敏度和特异度不理想[4]。miR-221是近年来发现的一个小RNA分子，在恶性肿瘤中高表达，与肿瘤发生、发展密切相关[5-6]。本研究通过检测前列腺癌患者、健康体检者和良性前列腺增生（BPH）患者血清miR-221表达水平，探讨其与临床特征的关系及诊断价值，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2014年1月至2016年12月在杭州市富阳区第一人民医院泌尿外科就诊的118例前列腺癌患者，年龄55~79（67.4±5.2）岁；接受全雄激素阻断治疗（MAB）治疗78例，前列腺癌根治性手术治疗31例，根治性放疗9例。纳入标准：（1）经前列腺穿刺活检或术后病理报告确诊为前列腺癌；（2）无远处转移；（3）入院前未接受过任何针对前列腺癌的治疗；（4）患者或家属签署知情同意书；（5）经医院医学伦理委员会审查通过。排除标准：（1）合并严重的肝、肾、脑、肺等疾病；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）患有严重的急慢性感染性疾病。另取30例健康体检者为健康组，30例BPH患者作为BPH组。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 使用橘黄色促凝采血管采集患者全血，翻转采血管，混合血液4~5次，使血液和促凝剂混合均匀。4℃环境温度下将采血管直立至血液完全凝固，1 000g条件下离心10min，分离血清。分装血清样本，液氮速冻，置于-80℃冰箱内保存。

1.2.2 血清miR-221水平检测 采用RT-PCR法。总RNA抽提：使用Trizol试剂（美国Gibco公司）提取血清样本总RNA。每200μl血清样本中加入3倍体积的Trizol试剂进行裂解。经过RNA沉淀、洗涤、溶解后，使用Agilent 2100生物分析仪（美国安捷伦科技有限公司）测量提取RNA的完整性，NanoDropND-1000（美国NanoDrop公司）测量提取RNA的浓度和纯度。逆转录反应按照miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技（北京）有限公司]说明书步骤进行，将RNase Free的反应管在0℃条件下预冷，然后内构建反应体系：RNA 3μl，mirVana RT Buffer（5×）2μl，1×mirVana RT Primer 1μl，Array script Enzyme Mix 0.4μl，加 RNasefree 水至总体积 10μl。反应条件：42℃ 60min，95℃5min，4℃急速降温。PCR反应按照 miScript Reverse Transcription Kit[天根生化科技（北京）有限公司]说明书步骤进行：5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4μl，50 ×ROX Reference Dye 0.4μl，PCR Forward Primer（20×）1μl，PCR Reverse Primer（20×）1μl，1×cDNA 模板

1~2.5μl，加入ddH2O至总体积20μl。PCR反应条件：95°C 15min；95℃ 5s，60℃ 30s，共 40 个循环。反应结束后分析PCR反应曲线，以U6为内参基因，采用2-ΔΔCT法计算miR-221相对表达量。miR-221引物序列：正向5′-GTTCGTGGGAGCTACATCTGGC-3′，反向 5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；U6 引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件。计量资料用表示，两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。血清miR-221相对表达量与血清PSA水平的相关性分析采用Pearson相关。绘制ROC曲线分析血清miR-221相对表达量对前列腺癌的诊断效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清RNA提取质量分析 所有对象血清样品中提取RNA的 A260/A280为1.96，28S和 18S核糖体 RNA电泳条带清晰明亮，其中28S条带强度约为18S条带的

2倍。这表明提取的血清总RNA完整性良好，无降解，满足实验需求。

2.2 3组对象血清miR-221相对表达量比较 健康组、BPH组和前列腺癌组血清miR-221相对表达量分别为 0.19±0.03、0.27±0.05 和 0.57±0.09，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中前列腺癌组明显高于健康组、BPH组（均P＜0.05），BPH 组高于健康组（P＜0.05），见图 1。

图1 3组对象血清m i R-221相对表达量比较

2.3 血清miR-221相对表达量与前列腺癌临床特征的关系 不同血清PSA水平、Gleason评分、病理分期、临床分期的前列腺癌患者血清miR-221相对表达量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；不同确诊年龄的前列腺癌患者血清miR-221相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 血清m i R-221相对表达量与前列腺癌临床特征的关系

2.4 血清miR-221相对表达量与血清PSA水平的相关性 118例前列腺癌患者血清miR-221相对表达量与血清PSA水平呈正相关（r=0.47，P＜0.05），见图2。

图2 血清m i R-221相对表达量与血清P S A水平的散点图

2.5 血清miR-221相对表达量诊断前列腺癌的价值血清miR-221相对表达量诊断前列腺癌的AUC为0.738（95%CI：0.714~0.885，P＜0.01）；截断值为 0.577时，血清miR-221相对表达量诊断前列腺癌的灵敏度为0.786，特异度为 0.645，见图 3。

图3 血清m i R-221相对表达量诊断前列腺癌的R O C曲线

3 讨论

miR-221是位于人类X染色体p11.3的一种内源性的、非编码的单链小分子RNA。研究发现，miR-221在甲状腺癌、脑胶质瘤、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤中均呈异常高表达[7-9]。研究发现，miR-221能靶向作用于 p27/Kip1、p57、BH3-only、ER-α、FOXO3、PTEN、TIMP3、DDIT4等抑癌基因，继而激活细胞周期和AKT旁路或阻断TNF相关凋亡诱导配体，最终发挥类似于致癌基因的效能来调控与恶性肿瘤发生、发展相关的生物学过程[10-13]。Zheng等[14]研究发现，前列腺癌细胞系LNCaP中miR-221过表达，可明显增加其神经元特异性烯醇化酶表达水平，进而诱导LNCaP细胞发生神经内分泌样改变；提示miR-221在前列腺癌神经内分泌化进程中起着促进作用。Sun等[15]发现miR-221高表达，可使LNCaP细胞的生长不受雄性激素的影响。通过系统的生化和生物信息学分析，确定Hectd2、Rab1A是miR-221的两个靶点。其中Hectd2下调会影响雄性激素/受体诱导和介导的转录，而抑制Hectd2或Rab1A会促进激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖；提示miR-221高表达可以介导前列腺癌细胞向CRPC表型的发展。Kneitz等[16]研究发现，miR-221不仅能直接抑制SOCS3和IRF2的表达，而且可以通过Stat1/Stat3介导的激活JAK/Stat信号通路来调控前列腺癌细胞的生长、凋亡和侵袭；该研究结果提示，在高危前列腺癌中，miR-221是癌症相关死亡的独立预测因子，可能为前列腺癌治疗与预后提供新的生物标志物和治疗靶点。

目前研究认为miR-221是高危前列腺癌的生物标志物，但是其作为前列腺癌肿瘤标志物的临床意义仍有待进一步探讨。Teixeira等[17]对77例肾细胞癌患者血液循环中的miR-221进行相对定量检测，结果发现肾细胞癌患者血液循环中miR-221表达异常高于健康者，且miR-221高表达与癌细胞转移及总体生存率相关。冀宏等[18]检测甲状腺癌组织中miR-221表达，并结合临床资料进行分析；结果显示miR-221表达水平与甲状腺癌病理分期、淋巴结转移等有关。本研究比较了前列腺癌患者、BPH患者和健康体检者血清miR-221相对表达量，结果显示前列腺癌组明显高于健康组、BPH组，差异有统计学意义；同时发现，血清miR-221相对表达量与前列腺癌患者血清PSA水平、Gleason评分、病理分期、临床分期等有关。PSA是临床上最常用的前列腺癌生物标志物，它在前列腺癌早期诊断和治疗检测中具有重要的临床意义[19]。本研究结果发现，血清miR-221相对表达量与血清PSA水平呈正相关。绘制ROC曲线评估血清miR-221相对表达量对前列腺癌的诊断价值，结果显示AUC值为0.738；取截断值时的灵敏度为0.786，特异度为0.645；提示miR-221相对表达量越高，患前列腺癌的可能性越大。

综上所述，前列腺癌患者血清miR-221表达明显升高，与其临床特征密切相关。血清miR-221高表达对前列腺癌具有一定的诊断价值。由于miRNA具有调控多个靶点基因的能力，未来可在miR-221的基础上开展针对前列腺癌的靶向治疗研究。