苏铁叶枯病病原菌鉴定研究

林钧

摘要：指出了在苏铁树上发现了一种叶枯病害，导致大量苏铁叶干枯，为明确其致病菌，采集了苏铁叶枯病叶片数份，对病原茵进行了致病性测定、形态学和分子生物学鉴定。结果显示：病原茵接种后能够产生与采集样本相同的痛害症状。确定其为致病菌;对病原茵进行形态学鉴定发现病原茵的分生孢子器、分生孢子的形态与拟茎点霉相同;通过分子生物学鉴定可知待测茵株rDNA-ITS的序列与GenBank中吸虫疫苗的rDNA-ITS的序列同源性可这97%。根据该病原茵的形态学特点以及rDNA-ITS测序结果可知：苏铁叶枯病病原菌为嗜血杆茵。

关键词：苏铁;叶枯病;病原茵;嗜血杆菌

中图分类号：$763文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）17-0097-02

1引言

苏铁，俗称“铁树”，具有很高的观赏价值和人文价值，在世界上广为栽培观赏和利用。但近年来苏铁叶枯病病害严重，导致大量苏铁叶干枯，大大影响了苏铁的观赏价值。该病症状是初发病时，苏铁叶尖或叶片上出现黄色斑点，病斑呈圆形状凹陷，随着病情发展，病斑颜色逐渐转为黄褐色，严重时再由黄褐色发展为具有黑色小粒点的灰白色，该黑色小粒点就是病原菌的分生孢子器。笔者对苏铁的叶枯病进行了致病性测定、形态学和分子生物学鉴定，旨在找出其致病的病原菌，为苏铁叶的防治提供理论依据。

2材料与方法

2.1材料

在2015～2018年间，每年的5～8月，分别从福州植物园、华南植物园、仙湖植物园的苏铁园内采集发病的苏铁叶子数片。

2.2方法

2.2.1病原菌的分离纯化

取灭菌培养皿于操作台中，用无菌操作法向培养皿中加入1～2滴25%的乳酸，再倒入10～15mL的pda培养基，摇动使之呈平面。培养好平板培养基后，取发病的苏铁叶，用剪刀从病健交界处剪取典型的病斑小块组织，将病变组织放在70%酒精中浸3～5s后移入0.1%升汞液进行表面消毒，再放入灭菌水中漂洗。完成后用无菌操作法将病变组织放人平板培养基中，每块培养皿可放4～6块，然后将培养皿置于恒温箱内培养。之后使用稀释分离法将较为整齐一致的菌落挑取出来进行斜面培养，多次进行分离纯化直到获得纯种菌株。

2.2.2病原茵的致病性测定

取健康的苏铁叶片分为对照组和实验组。用75%酒精对苏铁叶片进行表面消毒，使用刺伤法和无伤接种在实验组叶片上接种3个接种点，接种分离纯化后的5mm的菌饼，对照组叶片上接种2个接种点，接种5mm无菌的PSA培养基。将接种后的叶片放入培养皿中在25℃、光照1500Ix的培养箱中进行培养，观察接种结果，将出现病斑的叶片进行组织分离，确定致病菌株。

2.2.3茵落的培养特征和形态学鉴定

在25℃、PSA平板上培养致病菌株数日，记录菌株的培养特征。完成致病性测定后，用针尖将接种成功的叶片上的小黑点挑取出来置于玻片中，在光学显微镜下观察分生孢子器和分生孢子的形态、大小。

2.2.4病原茵的分子生物学鉴定

取0.5g茵丝在加入石英砂的研钵中研磨至粉状，加入已预热至65℃的3mLDNA提取缓冲液，充分振荡混匀后65℃水浴30min，之后加入1mL5MKAC，冰浴20min，取等体积的24：1的氯仿和异戊醇混合，在12000r/min、5℃下离心5min，再取上清液加入2/3体积的已预冷至-20℃异丙醇，混匀，静置30rain。再用玻璃棒挑取出其中的絮状沉淀，用75%的乙醇反复冲洗，再用无水乙醇漂洗，吹干后置于5L TE中，加入1uL的RNaseA于37℃处理1h，加入25：24：1的pH=8的苯酚、氯仿和异戊醇，在12000r/rain，4℃下离心，取上清加人1/10V 3M NaAc，2.5V体积的无水乙醇，在一70℃沉淀30min以上，取沉淀用75%无水乙醇冲洗，吹干后溶于200uL无菌水中，在-20℃下保存备用。

选用通用引物ITSl（5-TCCGTAGGTGAACCT-GCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3）对提取得到的病原菌DNA进行扩增，扩增结束后，取5uL的扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，在NCBI网站中将测出的ITS序列进行同源性分析，将分析得出的序列提交到GenBank，然后在其中选择合适的序列，用CLUSTALW2.0软件对比序列，同时使用MEGA5.05中的NJ构建系统发育树。

3结果与分析

3.1病原菌的分离纯化

经过分离纯化，共获得病原菌菌株20株，编号为A01-20。回接后发现其中的A05、A08、A11、A17均为非致病菌，其余菌株形态基本一致，后面进行病原菌的致病性测定和形态学鉴定使用A07菌株。

3.2病原菌的致病性测定结果

实验组的叶片在接种2d后刺伤接种点出现褐色病斑且随着时间推移扩散，第9d开始出现叶片干枯现象，13d后出现黑色的分生孢子器，15d后叶片完全变成褐色。将病害叶片上的病原菌进行分离培养，发现分离物的形态特点与实验组接种的供试菌株形态特点相同，由此可知供试菌株即为苏铁叶枯病的致病菌。

3.3病原菌的形态学鉴定结果

光学显微镜下可观察到分生孢子器大小约为255～425mm，有球状和扁球状。器壁为褐色，有孔口。压迫后可出现甲型分生孢子，大小约为（5.11～10.4）ptm×（2.0～4.6）p.m，呈无色纺锤状，其中有2～3个油球，未观察到乙型分生孢子。分生孢子梗为无色，呈分隔状或簇状。

将菌株进行培养4d后，发现菌丝为白色绒毛状、呈辐射状生长;6d后菌丝的背面开始出现黑色小粒点;15d后正面出现黑色的分生孢子器;30d后正面的黑色小粒点喷出黄色的分生孢子。取黄色的分生孢子置于光学显微镜下观察，除观察到甲型分生孢子外，还有乙型分生孢子，大小约为（15.25～51.78）p.m×（0.7～1.25）um，为单胞、线性、无色且无油球的真菌。

3.4病原菌的rDNA-ITS测序结果

对病原菌的DNA进行扩增可得到一条600bp左右的条带，测序目的片段长度为527bp，将测得的DNA序列与GenBank中的DNA序列进行同源性对比，发现菌株A07与GenBank中的Phomopsis vaccinii的同源性最高可达97%，而构建的系统发育树中发现该病原菌与拟茎点霉菌株的遗传距離最近，但该病原菌又不是Phomopsis vaccinii，由此可知该病原菌为Phomopsiscycacis。

4结论与讨论

我国关于拟茎点霉引起的苏铁叶枯病的论文很少。本人通过对A07病原菌DNA的测序发现与拟茎点霉的Phomosis vaccinii的同源性最高，同时构建出的系统发育树中显示，Phomosis vaccinii和Phomosis cycadis支持率达98%，但是两者的形态学特点具有很大的差异。根据对A07病原菌的形态学鉴定和培养特性显示苏铁叶枯病病原菌的形态特点与Phomosis cycadis相似。因此可以鉴定苏铁叶枯病的致病菌为拟茎点霉Phomosis cycadis