硫磺负离子添加剂对大鼠亚慢性毒性试验

张剑锋， 姜成哲*， 李 镐， 片永泰

(1.延边大学农学院；2.延边大学药学院；3.延吉市宏大饲料有限公司:吉林 延吉 133000 )

矿物饲料添加剂是饲料添加剂的一种，因为天然饲料的矿物质不能满足动物生长发育的需要，加上动物体内存在着对矿物质吸收利用有抑制作用的因素，所以在动物饲料中添加矿物饲料添加剂是十分必要的。目前我国常用的矿物饲料添加剂有食盐、碳酸钙骨粉等，新开发的添加剂有石灰岩，沸石粉和膨润土等[1-2 ]。

硫的排泄途径主要有经粪排泄和尿排泄2种，饲料添加剂中无机硫超量时，才有可能使动物产生厌食、失重、便秘、腹泻及抑郁等毒性反应，严重时可引起动物死亡[3-4]。

硫磺负离子饲料添加剂是延吉市宏大饲料有限公司采用纳米技术加工电气石粉、硫磺矿物粉与锗矿粉，按特殊加工工艺制作而成，其主要成分为硫磺粉、电气石粉、石粉、大豆粉及锗矿粉。目前已有报道硫磺负离子饲料添加剂能够提高延边黄牛背最长肌中鲜味氨基酸、不饱和脂肪酸和必需氨基酸的含量，降低饱和脂肪酸的含量；对黄牛的养分表观消化率和生长性能的提高有很大影响；可降低延边黄牛血液中甘油三酯与总胆固醇含量，并且可以提高血液中免疫球蛋白、高密度脂蛋白的含量；还可以提高牛肉中粗蛋白的含量。硫磺负离子在急性毒性方面属于无毒级物质[5-6]。

该试验以硫磺负离子饲料添加剂饲喂大鼠90 d，研究其亚慢性毒性作用，为硫磺负离子饲料添加剂的安全性评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

硫磺负离子饲料添加剂购自于吉林省延吉市宏大饲料有限公司。专利号：201210031981.7，主要成分：硫磺粉46%、电气石粉38%、石粉7%、大豆粉5%、锗矿粉4%。

1.2 动物及饲养条件

清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，清洁级，体重在200 g以上，由延边大学实验动物中心提供。所有大鼠饲养于延边大学药学院动物室，动物室的温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%，每天12 h日光灯照明，清洁级颗粒饲料饲养，动物饲料在延边大学动物中心加工，试验过程中大鼠自由摄食颗粒饲料和饮水。

1.3 主要仪器设备

常规解剖器械，UV759CRT紫外可见光分光光度计购自于上海佑科仪器仪表有限公司，CT15RT台式高速冷冻离心机购自于上海天美科学仪器有限公司，DG8全自动血液生化分析仪购自于南京华东有限责任公司。

1.4 方法

1.4.1 试验设计

实验动物饲养适应观察20 d后，分别将雌雄大鼠随机分成4组，每组雌雄大鼠各10只，分别为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。对照组用普通饲料饲养，低剂量组、中剂量组和高剂量组分别以含有0.3%、0.9%和2.7%硫磺负离子的饲料饲养。连续饲喂90 d。

1.4.2 试验方法和观察指标

每日给大鼠添加饲料和饮水，观察记录大鼠饮食饮水、外部特征(毛发、皮肤、眼和黏膜的变化)、活动情况、精神状态，记录有无异常的中毒症状或死亡的，每周称量大鼠体重及摄食量并记录。饲喂90 d后，雌雄大鼠用乙醚麻醉后进行采血和剖检，系统解剖脑、心、肺、肝、胃、脾、胸腺、小肠、大肠、肠系膜淋巴结、肾、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫等脏器情况，记录所见异常变化。用电子天平称取脑、心、肝、胸腺、脾、肺、肾、肾上腺、睾丸、子宫重量，测定其脏器重量系数。脏器系数以每100 g体重所对应的脏器质量来表示。

1.4.3 血液样品的采集及血常规测定

用乙醚将大鼠麻醉后，打开腹腔在后腔静脉采集血液2份，分别置于2 mL离心管中，其中，1份加10%EDTA抗凝剂少许在4 ℃条件下保存，另1份3 500 r/min离心15 min后取上清于-20 ℃保存备用。然后取抗凝血进行红细胞计数，白细胞计数和白细胞分类计数。

1.4.4 血生化指标检测

将采集的大鼠血清采用DG8全自动生化分析仪测定其中的钾(K)、钠(NA)、氯(CL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、胆碱酯酶(CHE)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、清球比(A/G)、总胆固醇(CHO)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、磷(P)、钙(GA)、葡萄糖(GIU)。

2 结果与分析

2.1 硫磺负离子添加剂的大鼠亚慢性毒性试验处理对大鼠体重的变化

试验期间各组动物的基本情况良好，无厌食、死亡和其它异常行为，通过每周对大鼠体重的记录，发现雌性高剂量组在第28天和第49天时，与对照组有显著性差异(P<0.05)，其余各组与对照组相比，无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 硫磺负离子添加剂对大鼠体重变化的影响

注：*表示与对照组相比，P<0.05。

2.2 硫磺负离子添加剂的大鼠亚慢性毒性试验处理对大鼠脏器系数的变化

硫磺负离子添加剂的大鼠亚慢性毒性试验各组大鼠末期(90 d)的统计结果表明，试验中期高剂量组雌性大鼠肺的脏器系数高于对照组，并且差异显著(P<0.05)，其余各组与对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)；试验末期低剂量组雄性大鼠肾脏的脏器系数与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)，中剂量组雌性大鼠胸腺的脏器系数与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)，其余各组与对照组相比，均无显著性差异(表2)。

表2 硫磺负离子添加剂对大鼠亚慢性毒性试验脏器系数影响(X±SD)

注：*表示与对照组本比，P<0.05。

2.3 硫磺负离子添加剂大鼠亚慢性毒性试验各组大鼠血液学检查结果

试验雌雄性大鼠末期低、中、高3个剂量组的血液学检查结果与对照组相比，均无显著性差异(表3)。

表3 硫磺负离子添加剂对大鼠血液学检查结果

2.4 硫磺负离子添加剂大鼠亚慢性毒性试验各组大鼠血清学检查结果

试验末期雌雄大鼠各个试验组的血清学检查结果与对照组相比，无显著性差异(表4)。

表4 硫磺负离子添加剂对大鼠血清生化检查结果(X±SD)

2.5 硫磺负离子添加剂大鼠亚慢性毒性试验各组大鼠组织学检查结果

通过光学显微镜对组织切片的观察，未发现组织有异常。

3 讨论与结论

动物的体重可以大致反映动物体在各生长发育阶段的营养状态、健康状态和生理状况。试验期间各组试验动物基本情况良好，无厌食、死亡和其它异常行为出现。试验组大鼠体重变化处于平稳状态，仅发现雌性高剂量组在第4周(28 d)和第7周(49 d)时，与对照组有显著性差异(P<0.05)，体重平均水平低于对照组。这种现象可能是一些不确定因素(例如大鼠一段时间内食欲不好，加上硫磺负离子剂量过高导致饲料适口性差)造成的，李应超等[7]在酸枣仁口服液雏鸡亚慢性毒性试验时也出现了同样的现象，并认为这并不代表试验药物对动物产生毒性。

试验末期雄性大鼠试验组体重的平均值大于对照组，这表明硫磺负离子饲料添加剂对雄性大鼠的生长有一定的促进作用。原因可能是试验初期，试验组大鼠的饲料由普通饲料突然变换为含有硫磺负离子的饲料大鼠有些不适应，加上硫磺负离子对胃肠有一定的刺激作用。随着大鼠的适应，饲料利用率也开始相对上升。雌性大鼠和雄性大鼠在生长发育方面有一定的差异，这也导致了雌性和雄性大鼠对硫磺负离子的利用效果不同。

该试验脏器系数的结果显示，试验末期同组大鼠肺的脏器系数没有显著性差异，试验末期低剂量组雄性大鼠肾脏的脏器系数与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)，中剂量组雌性大鼠胸腺的脏器系数与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)，而与之相对应的高剂量组都没出现统计学上的差异。这显然不符合剂量—反应关系，并且高剂量组大鼠肾脏未见明显的病理组织学变化，故认为是非特异性的病理改变。

试验末期各组大鼠红细胞和白细胞数量以及中性百分比、淋巴百分比、其它百分比都与对照组没有显著性差异，血细胞数值在正常范围内[8]，说明硫磺负离子饲料添加剂没有对血常规造成不良的影响。

血清生化指标是临床诊断和治疗疾病的重要依据，试验末期对照组和试验组大鼠血清生化指标都在正常范围内[8]，没有统计学上的差异。

最近以来，随着很多学者对天然产物和微量元素的多项毒理学及基础研究[9-14]和饲料营养学者及饲料企业不断优化饲料配方以及改进饲料加工技术[15]，我国的饲料产业将不断发展。

总之，硫磺负离子饲料添加剂喂养大鼠90 d没有产生毒性，最适添加量为0.9%。