鱼源鲁氏耶尔森菌mobBC基因无痕缺失株的构建及其毒性研究

刘 韬，魏文燕，刘家星，汪开毓

(1.四川农业大学鱼病研究中心，四川成都611130；2.成都市农林科学院，四川成都610000)

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)主要引起鱼类的肠炎红嘴病(ERM)，该病是一种重要的水生动物疾病，最早在1966年美国爱德荷州的养殖虹鳟鱼(Rainbow trout/Oncorhynchus mykiss)中暴发[1]， 随 后传至欧洲。目前该病主要在英国和欧洲大陆之间传播，宿主一般为在淡、海水中的野生鲑鱼和养殖鲑鱼[2]。然而自ERM 首次报道以来，其宿主范围和地理分布均在逐渐扩大。此外，ERM 存在水平传播的威胁，无明显症状的带菌鱼体和部分鸟类均可携带Y.ruckeri[3-4]。

本实验室前期通过全基因组测序和比较基因组学研究发现Y.ruckeri具有特异性的四型分泌系统(Type IV secretion system，T4SS)[1]。T4SS 是一种大分子传递装置，进化自细菌的接合系统[5-6]。多数致病性胞内菌利用其传递DNA 或毒性蛋白到宿主细胞内，帮助其增殖和逃避宿主的免疫攻击[6]。根据T4SS 结构的不同将Y.ruckeri分为 IVA 型(T4ASS)和IVB 型(T4BSS)[7]。本研究分离的Y.ruckeriSC09 株的染色体中带有virB2-virB11基因簇，属于T4ASS。综合上下游基因分析发现，该基因簇位于一个基因水平转移的ICE (Integrative and conjugative element)元件内部[8]。同时，本实验室预测到位于ICE 中的mobBC基因是负责ICE 元件接合转移的重要因子，可能对菌株T4SS 功能的发挥和菌株的毒性有重要影响。目前，关于Y.ruckeri致病机制的研究比较有限，而关于mobBC基因和ICE 的研究还未开展。因此，本研究通过建立Y.ruckeriSC09 无痕mobBC缺失株并初步研究其致病机制，旨在为进一步研究mobBC基因和ICE 元件在Y.ruckeri致病过程中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料质粒pLP12[9]和大肠杆菌β2163[10]购自广州迈博生物科技有限公司；DH5α λpir 感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株由四川农业大学动物医学院鱼病研究中心提供[1]。SPF 级雌性小鼠(25 g～30 g)购自成都达硕实验动物有限公司；虹鳟鱼(80 g～100 g)由四川农业大学鱼病研究中心提供；鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)SC09 株全菌多克隆抗体(兔)由四川农业大学鱼病研究中心提供。

1.2 主要试剂2×TSINGKE Master Mix 购自北京擎科新业生物技术有限公司；DNA Marker 和DNA纯化回收试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；氯霉素、质粒DNA 小量提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；酵母提取物(Yeast extract)、胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)购自英国OXOID 公司；2,6 - 二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)、L- 阿拉伯糖购自北京索莱宝科技有限公司；细菌全基因组提取试剂盒、Goldview、琼脂糖均购自天根生化科技(北京)有限公司；重组酶Exnase II购自Vazyme 公司；TTC 购自Sigma 公司。

1.3 引物设计参考GenBank 中Y.ruckeriSC09 株(NZ_CP025800)mobBC基因序列 (NJ56_12460)， 设计扩增mobBC基因左、右同源臂引物：mobBCMF1/MR1(上游，A)和mobBC-MF2/MR2(下游，B)，同时，参考mobBC上、下游基因序列设计引物mobBC-TF/TR 用于阳性缺失株Y.ruckeriΔmobBC检测。引物pLP-UF/UR 用于重组载体pLP12-mobBC检测(表 1)。

表1 本研究用到的引物Table 1 All the primers involved in this study

1.4 自杀载体pLP12-mobBC 的构建与鉴定构建mobBC基因的左右同源臂AB，将AB 克隆入pLP12构建重组质粒pLP12-mobBC(图1)。具体操作如下：分别采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR1 和mobBCMF2/mobBC-MR2，以提取的Y.ruckeri全基因组DNA 为模板进行PCR 扩增。扩增程序：98 ℃3 min；98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 7 min。DNA 回收试剂盒纯化PCR 产物，获得mobBC基因左、右同源臂的A、B 序列片段。以体积比1∶1 混合 A、B 片段作为模板进行自延伸：98 ℃ 1 min； 98 ℃ 10 s，68 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，7个循环；随后采用引物mobBC-MF1/mobBC-MR2 进行左、右同源臂的融合 PCR 扩增：98 ℃ 10 s，56/58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，30 个循环，72 ℃ 7 min。扩增产物利用DNA 回收试剂盒纯化，得到融合AB片段，-20 ℃备用。

利用重组酶Exnase II (ClonExpress II，Vazyme)，37 ℃ 孵育 30 min 后，将质粒载体 pLP12 与 AB 融合片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α λpir，将转化菌体涂布于20 μg/mL CM-LB 抗性固体培养基(氯霉素，Chloramphenicol)。挑取单个菌落，采用引物pLP-UF/pLP-UR 进行菌落PCR 验证，筛选的阳性克隆菌扩大培养，并提取质粒pLP12-mob-BC，-20 ℃备用。

1.5 pLP12-mobBC/β2163 供体菌构建将 pLP12-mobBC电转化常规方法制备的大肠杆菌β2163 感受态细胞。转化条件：1.8 kV/cm，200 Ω，25 μF，电转完成后加入1 mL 的DAP-LB 液体培养基，37 ℃复苏l h；取复苏菌液 100 μL 涂布LB 平板(CM=20 μg/mL，DAP=0.3 mmol/L，0.3%D-葡萄糖)，37 ℃培养12 h。挑取氯霉素抗性的阳性菌株并命名为pLP12-mobBC/β2163。

1.6 插入突变株、缺失突变株和回补株的构建及鉴定将 pLP12-mobBC/β2163 与鲁氏耶尔森菌 SC09株共培养并产生接合效应，随后在LB 平板(20 μg/mL CM+0.3 % D-葡萄糖)筛选发生第一次同源重组的插入突变的SC09 菌株。具体操作如下：将pLP12-mobBC/β2163 与Y.ruckeriSC09，分别过夜培养后，各取100 μL 菌液混合，离心弃上清，再加入10 μL新鲜LB 重悬并涂布DAP-LB 平板，30 ℃培养12 h。用1 mL LB 洗下所有菌体并取100 μL 涂布CM-LB平板。取平板上单菌落，以引物mobBC-MF1/mob-BC-MR2 进行菌落PCR 鉴定。将正确的插入突变株命名为pLP12-mobBC/SC09。

将 pLP12-mobBC/SC09 在 LB 平 板 (0.4 % L- 阿拉伯糖)进行筛选，得到发生第二次同源重组的mobBC基因缺失株。具体操作如下：将pLP12-mob-BC/SC09 接种LB 液体培养基，振荡培养2 h，取100 μL 菌液涂布 0.02 % L- 阿拉伯糖的 LB 平板，37 ℃培养12 h；取平板上单菌落，扩大培养后提取其全基因组DNA，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 进行PCR 扩增，并由上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定。将鉴定正确的无痕突变株命名为Y.ruckeriΔmobBC，-20 ℃保存备用。

本研究针对mobBC基因的敲除策略如图1 所示。

图1 鲁氏耶尔森菌SC09 mobBC 基因的缺失策略Fig.1 The strategy of mobBC gene knockout in Y.ruckeri SC09

同时，参考Luo P 等[9]的方法，利用pBAD33cmmobBC载体以接合转移的形式回补SC09ΔmobBC菌株，并以阿拉伯糖诱导mobBC基因表达，同上经PCR 鉴定并测序后得到回补株，命名为Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC。

1.7 菌体电镜学形态观察和生长曲线测定将培养后的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBCPBS 洗涤8 次，0.5 %戊二醛固定，送成都里来生物科技有限公司进行扫描电镜和透射电镜观察。

取对数生长期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC、回补株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分别培养至OD600nm值为0.1，随后于37 ℃振荡培养，每隔2 h 定时取样于分光光度计上测定OD600nm值，并绘制菌株生长曲线，比较三者生长特性。

1.8 缺失株感染实验将对数生长期的Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC分别以 3×107cfu 的剂量经肌肉接种SPF 小鼠，每组30 只；将大肠杆菌DH5α 以同样的方法感染30 只小鼠作为阴性对照。记录小鼠死亡情况，并利用GraphPad Prism version 8.0 软件进行小鼠生存曲线分析和绘制。

在小鼠感染实验基础上，进一步验证菌株在虹鳟鱼体内的毒性。取对数生长期野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回补株分别以腹腔注射的方式(剂量：5×107cfu)接种随机分组的30 条虹鳟鱼，记录鱼死亡情况，并利用GraphPad Prism version 8.0 软件进行虹鳟鱼生存曲线分析。同时无菌采集各组死亡虹鳟鱼的肝脏、脾脏和肾脏各50 mg 分别匀浆后，10 倍稀释5 次，利用平板技术法在含有TTC 的营养琼脂的平板上进行细菌计数，统计各脏器细菌感染数量。同样方法采集感染中期(感染后48 h)虹鳟鱼肾脏(细菌感染鱼类的主要靶器官)制备常规石蜡切片和HE 染色，观察，拍照，利用纯化的兔抗Y.ruckeri多克隆抗体，利用免疫组织化学方法对虹鳟鱼的肾脏石蜡切片进行细菌感染分布的研究，进一步确认不同菌株的感染强度。

2 结 果

2.1 mobBC 基因同源臂构建采用引物mobBCMF1/mobBC-MR1 扩增得mobBC基因A 片段，得到545 bp 目的片段；采用引物mobBC-MF2/mobBCMR2 扩增得mobBC基因 B 片段，得到504 bp 目的片段。以上述A、B 片段为模板，进行融合PCR 扩增，AB 片段采用胶回收DNA 纯化试剂盒纯化，经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示融合AB 片段长1 004 bp，与预期相符(图2)。结果表明，同源臂正确构建。

图2 mobBC 同源臂构建Fig.2 mobBC homologous arms

2.2 pLP12-mobBC/β2163 供菌体的构建利用引物pLP-UF/pLP-UR PCR 鉴定，结果显示正确克隆得到 1 213 bp 的 PCR 产物(图3)，空载体为 260 bp 产物，表明 pLP12-mobBC已转化 DH5α λpir。扩大培养阳性克隆，提取质粒pLP12-mobBC，电转化大肠杆菌β2163，涂布LB 平板，挑阳性克隆，利用上述PCR 鉴定，结果显示得到含质粒pLP12-mobBC的pLP12-mobBC/β2163。以上结果表明 pLP12-mobBC载体和供体菌pLP12-mobBC/β2163正确构建。

2.3 插入突变株的构建挑取筛选平板上单克隆并纯化，进行菌落PCR 鉴定，结果显示，野生株扩增的到3 483 bp 片段，插入突变产生965 bp 片段(图4)。一次同源重组未删除野生株染色体序列，所以插入突变株仍能检测到3 483 bp 的片段，但野生株却无965 bp 的片段(图4)。表明插入突变株pLP12-mobBC/SC09 正确构建。

图3 pLP12-mobBC 质粒构建鉴定结果Fig.3 Identification of recombination plasmid pLP12-mobBC

图4 插入突变株PCR 检测结果Fig.4 Identification of insertional mutants

2.4 缺失突变株构建取插入突变克隆进行二次同源重组，挑取平板上的克隆，以引物mobBC-TF/mobBC-TR 进行检测，并测序验证比对，结果显示正确的缺失突变克隆扩增得到1 230 bp 片段，而野生型菌株及回补株(图略)扩增片段长3 748 bp (图5)。表明mobBC无痕缺失突变株Y.ruckeriΔmobBC正确构建。

图5 缺失株PCR 检测结果Fig.5 Identification of deletion mutants by PCR

2.5 菌体电镜观察利用透射电镜进行观察，可见缺失株和野生型菌株在菌体形态上未表现出明显差异(图6)，表明mobBC基因与Y.ruckeri菌体结构无明显相关性。

图6 鲁氏耶尔森菌野生株与缺失突变株的电子显微镜照片Fig.6 Electron microscope of wild type Y.ruckeri and Y.ruckeri ΔmobBC

2.6 细菌生长曲线测定取对数生长期的野生型Y.ruckeri和Y.ruckeriΔmobBC及回补株Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 分别培养，测定各时间点OD600nm值，绘制生长曲线，结果显示，在18 h 的培养过程中，Y.ruckeriΔmobBC生长性能始终低于野生型菌株，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回补株的生存曲线与野生菌株接近，且分光光度值也始终高于缺失株(图7)。表明mobBC基因缺失对菌株的增殖生长有较大影响。

图7 Y.ruckeri 野生型、缺失株Y.ruckeriΔmobBC及回补株的生长曲线Fig.7 Growth curve of wild type Y.ruckeri, deletion mutants and complemented strains

2.7 小鼠感染试验结果为了初步了解缺失株Y.ruckeriΔmobBC在生物体内毒性的变化，本研究进行了小鼠的急性感染实验。结果显示，感染野生型Y.ruckeri后所有小鼠在第7 d 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的小鼠约在第 14 d 全部死亡。大肠杆菌的感染基本不会在14 d 内造成小鼠死亡。同时，生存曲线分析显示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株之间存在显著差异(p＜0.01；**)(图8)。以上结果表明，Y.ruckeriΔmobBC对模式小鼠仍然存在毒性，但是其毒性明显弱于野生型菌株。这表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潜在的毒力因子。

2.8 虹鳟鱼感染试验结果为进一步验证Y.ruckeriΔmobBC在易感鱼类的毒性变化，将野生型菌株和Y.ruckeriΔmobBC， 以及回补株Y.ruckeriΔmob-BC+pMobBC 分别腹腔感染虹鳟鱼。结果显示。感染野生型Y.ruckeri后所有虹鳟鱼在第64 h 全部死亡，而感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鳟鱼在整个实验周期(96 h)的后期(87 h～96 h)才开始出现明显死亡。同时，生存曲线分析显示感染Y.ruckeriΔmobBC和感染野生型Y.ruckeri菌株的虹鳟鱼之间存在显著差异(p＜0.01；**)，而Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回补株与野生型菌株感染虹鳟鱼后其生存曲线相似，无显著性差异，但与缺失株Y.ruckeriΔmobBC感染虹鳟鱼的生存曲线存在显著差异(p＜0.01；**)。以上结果表明，急性感染实验中Y.ruckeriΔmobBC对易感鱼类仍然存在较弱的毒性，但其毒性强度明显低于野生型菌株(图9)。这进一步表明mobBC基因可能是Y.ruckeri潜在的毒力因子。

图8 野生株与Y.ruckeriΔmobBC 感染模式小鼠生存曲线分析Fig.8 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in mice

图9 野生株与Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鳟鱼生存曲线分析Fig.9 Survival curve analysis of Y.ruckeri acute infection in rainbow trout

为进一步充分验证Y.ruckeriΔmobBC在易感鱼类上的毒性强度减弱的趋势，将上述急性感染鱼体(分别取15 条鱼)的重要组织器官(肝脏、脾脏和肾脏)分离匀浆后进行组织内感染细菌平板计数，结果显示，各组织中Y.ruckeriSC09ΔmobBC感染的细菌数量均低于野生型菌株，但是肝脏和脾脏总体细菌感染量(103cfu～104cfu)均低于肾脏组织的细菌感染数量(105cfu)(图10)。且ΔmobBC感染与野生型菌株感染和Y.ruckeriΔmobBC+pMobBC 回补株感染多器官之间细菌计数结果均存在显著差异(p＜0.01；**)。表明肾脏组织可能是菌株感染的重要靶器官。

图10 虹鳟鱼各组织感染细菌的平板计数Fig.10 The bacterial load in the tissues of rainbow trout

进一步对急性感染虹鳟鱼(感染后48 h)的肾脏组织进行常规组织病理学观察和免疫组织化学实验，结果显示，感染野生型菌株虹鳟鱼的肾脏组织出现明显的肾小管透明滴状变，滴状物大小不等、圆形、半透明、红染(图11A)；同时，免疫组化分析中感染野生型菌株虹鳟鱼的肾脏组织中存在大量阳性信号(图11C 箭头所示)。感染Y.ruckeriΔmobBC的虹鳟鱼肾脏组织结构未见明显病理变化(图11B)，且免疫组化分析中未见有明显阳性信号(图11D)。表明Y.ruckeriΔmobBC感染虹鳟鱼48 h 内，其感染靶器官(肾脏)的感染强度明显低于野生型菌株。进一步表明mobBC基因的缺失会导致菌株毒性降低。

图11 野生株与Y.ruckeriΔmobBC 感染虹鳟鱼的肾脏组织病理和免疫组织化学检测结果Fig.11 Histopathology and immunohistochemistry of infected rainbow trout kidney during Y.ruckeri acute infection

3 讨 论

目前对于mobBC基因的研究，尤其是其对菌株毒性的影响的研究还较薄弱。为了解mobBC基因对Y.ruckeri的毒性影响，本研究通过无痕基因缺失的方法获得了缺失株Y.ruckeriΔmobBC。研究发现，在外部充足营养条件下，Y.ruckeriΔmobBC与野生型菌株相比，虽然外观超微结构变化并不显著，但是表现出较弱的菌株增殖力，且还表现出对模式小鼠和虹鳟鱼明显减弱的毒性。尤其在肾脏等靶器官感染过程中，Y.ruckeriΔmobBC对组织的感染能力和引起的组织损伤程度均明显低于野生型菌株。由此，推测mobBC基因缺失虽然只是菌株基因组层面的变化，不会导致细菌外形结构改变，但将导致菌株复制能力下降，从而降低菌株在宿主体内的毒性。菌株复制和增殖力的下降可能是菌株毒性下降的重要标志。在后期的菌株毒性研究中，可把与菌株增殖力相关的基因也纳入毒性基因的考量范畴，这将增加对菌株毒性研究的深度。mobBC基因缺失也为后期对该基因和SC09 株的T4SS 的功能性探索奠定了基础。

过去，基于sacB基因的反向筛选一般是原核生物基因缺失策略首选方案[11]，但sacB基因编码的SacB 蛋白活性却对培养基中的NaCl 敏感，而培养基中NaCl 是必要添加物[12]。SacB 活性降低会导致筛选正确突变株的成功率极大降低。因此，缺少合适的反向筛选标记是细菌基因编辑面临的主要障碍。2007年，Roux 等利用基于ccdB基因的自杀载体构建了vsm 基因缺失的灿烂弧菌[13]。但源自大肠杆菌F 质粒的CcdB 蛋白的性未必对所有细菌有效，因为CcdB 的活性是失活细菌的GyrA (DNA 促旋酶亚基)[14]，而细菌之间的GyrA 蛋白构象存在差异，导致CcdB 活性失效。2015年，Peng Luo 等探索了大肠杆菌LP79 中来自拟态弧菌接合转移的MGIV-mi1 基因岛中的vmi480 基因和vmi470 基因的功能[9]。vmi480 和vmi470 组成了有独立启动子的操纵子，结构类似于 TA (toxin-antitoxin)系统[15-16]。Peng Luo等试图单独缺失vmi470，未果，而缺失vmi480 或者将vmi470 和毗邻的vmi480 一起缺失却获得成功[9]。进一步研究发现单独表达vmi480 对细菌细胞致死，而致死效应在 vmi470 和vmi480 共表达时消除[9]。Vmi480 对大肠杆菌表现出强致死性，表明虽然毒性蛋白来自于弧菌，但它对各种来源的细菌均产生毒性作用[17-19]。另一方面，vmi470 和vmi480 只存在少数弧菌中[20]，因此vmi480 可作为一种新反向筛选标记应用于细菌基因缺失中。本研究中基于vmi480 基因的自杀质粒pLP12 和β2163 高效接合系统首次在Y.ruckeri中缺失了T4SS 的核心基因mobBC，获得了无抗生素标记的Y.ruckeri的mobBC基因无痕缺失突变株。因此，本实验同时表明vmi480 可以应用于鲁氏耶尔森氏菌基因编辑中的反向筛选。

综上所述，本文首次研究了Y.ruckeriSC09 的mobBC基因的毒性影响，为该病原菌的毒力研究增加了新的基础。同时也为vmi480 在鲁氏耶尔森氏菌研究中的应用提供了实验依据。