平喘宁调节PI3K/Akt 信号通路干预寒性哮喘大鼠气道重塑的机制*

李明明，屈 彬，方向明，

（1. 安徽中医药大学，安徽 合肥 230038；2. 中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230038）

支气管哮喘（bronchial asthma），简称哮喘，是一种由多种炎性细胞介导的呼吸道慢性炎症性疾病[1]。目前我国哮喘患者约有3 000 多万人[2-3]，患病率为1%～4%，并且我国哮喘患病率呈上升态势。PI3KAkt/PKB 信号通路在调节细胞存活、增殖和凋亡中占有重要地位，不仅参与细胞周期调节、凋亡、生长和细胞存活的广泛细胞反应，而且对细胞内高度复杂的信号网络的稳态有着重要作用[4-5]。平喘宁是我导师的经验方，近年来一直使用此方在临床上治疗寒哮，疗效明显，主要是由炙麻黄、细辛等11 味中药组成，其具有温阳化痰，散寒平喘之功。本次实验通过观察平喘宁干预寒哮大鼠肺组织PI3K-Akt/PKB 信号通路上的蛋白，检测其肺组织中ASK1、TSC1 的表达量，进一步探讨平喘宁在气道重塑方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 选用105 只周龄在6～8 周，体质量180～230 g，平均体质量（220.79±4.37）g 的SPF 级健康的雄性SD 大鼠。大鼠采购于安徽医科大学实验动物中心（许可证编号：scxk（皖）2017-001）。模拟昼夜，动物房温度控制在（21±1）℃，湿度控制在40%～70%，保持通风。大鼠饲料按照每只每日10 g，水瓶每日保持清洁并放置充足干净饮用水，每隔1 日更换垫料，清理鼠笼，同时打扫动物房并消毒。

1.2 药物 平喘宁：药物来源于安徽省中医院中草药房，由麻黄、细辛、杏仁、黄芪、苏子、陈皮等11 味中药组成。桂龙咳喘宁胶囊：桂龙医药（安徽）有限公司（批号：180112）。地塞米松片：上海信谊药业有限公司（批号：015170401）

1.3 试剂 卵蛋白（OVA）；Trizol（Life technogies 公司，批号90803）；逆转录试剂盒（批号00519963）：Thermo Scientific ；ASK1 抗体（abcam 公司，批号：ab39402）；TSC1 抗体（abcam 公司，批号：ab217328）二甲苯（批号20180310）、氯仿（批号20161013）。

1.4 仪器 超声雾化机，江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；生物组织自动脱水机，湖北亚光医用电子技术有限公司；徕卡切片机，Leica；荧光定量PCR 仪，Thermo Scientific；微孔板迷你离心机，杭州奥盛仪器有限公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 根据中医寒哮动物模型建立的方法[6-7]，在1 周适应性饲养后，第1 天及第8 天对除正常组之外的6 组大鼠腹腔注射1 mL 的悬液（由10%的卵蛋白与生理盐水配制而成），使其致敏；正常组由生理盐水代替此悬液进行腹腔注射。从第15 至21 天开始对除正常组之外的模型组、治疗组大鼠使用1%的卵蛋白悬液进行超声雾化，每次30 min，并且每天将大鼠置于寒冷箱中给予相同时间的寒冷刺激，以造出寒哮模型。正常组大鼠用生理盐水代替卵蛋白悬液进行雾化。

观察大鼠出现呼吸急促、腹部收缩明显、咳嗽、流清涕、精神颓废、呆板、活动度下降、畏寒、鼠毛散乱无华、大便溏、食量减少明显等现象时，提示寒哮模型造模成功。

自第22 天起参照人与动物之间的给药剂量换算得出平喘宁高、中、低剂量组每千克大鼠每日给药量分别为14.578 g·kg-1，7.289 g·kg-1，3.645 g·kg-1。桂龙咳喘宁剂量组每千克大鼠每日给药量则为0.405 g·kg-1。地塞米松剂量组每千克大鼠每日给药量为0.405 mg·kg-1，正常组、模型组灌胃等容积的0.9%氯化钠溶液，连续灌胃28 d。

2.2 取材 大鼠4 周灌胃完成后禁食24 h 然后进行末次激发，并在2 h 内快速地对所有大鼠进行称重，对每100 g 大鼠给予20 mg 药物（浓度为2%的巴比妥钠）进行腹腔注射麻醉取出大鼠肺组织，将左肺置于中性福尔马林中固定，右肺置于-80 ℃的冰箱中冻存。

2.3 病理检测 取出放置于中性福尔马林固定完成的大鼠左肺，进行脱水、包埋、切片、贴片、烘片及HE染色等步骤，最后在400 倍光镜下观察大鼠肺组织的形态学改变。

2.4 RT-qPCR 检测 1）RNA 提取。取60～70 mg 的大鼠肺组织放入EP 管中剪碎，然后在液氮中研磨，再加入1 mL TRIzol 匀浆；将EP 管在冰上放置2 min后，使用离心机在4 ℃及1 2000 rpm 地条件下将EP管中混合液离心10 min；向离心后的液体中加入0.2 mL 的氯仿，剧烈摇晃15 s，然后在室温下安静放置3 min；将上述步骤结束的液体接着放入4 ℃、12 000 rpm 的离心机中离心15 min，然后取500 μL 上清液加入另一EP 管中以备用；然后在EP 管滴加异丙醇0.5 mL，轻轻地摇晃是液体混匀，然后在室温下静置10 min，再次放入4℃、12 000 rpm 的离心机中离心10 min，将管内上清液吸取丢弃；在EP 管中加入1 mL 的75℅乙醇（DEPC 水配制）进行洗涤。然后在4℃、12 000 rpm 的离心机中离心5 min，然后将管内上清液吸取丢弃。然后将其敞口在室温条件下放置30 min，使沉淀的RNA 自然干燥；再次在EP 管中加入50 μL 的DEPC 水，放入55 ℃环境中10 min 加快RNA 的溶解，然后将RNA 溶液放置于-80 ℃冰箱中保存备用。2）RT 反应：1 μg RNA、10 μmol/L Oligo（dT）1 μL、DEPC 水补足至12 μL，点动离心；在PCR仪上65 ℃加热5 min，冰浴3 min；加5×反应缓冲液4.0 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、Revert AidTM M-MuLV 反转录酶1 μL、RibolockTM RNA 酶抑制剂1μL，PCR 仪上42 ℃加热60 min，70 ℃5 min；上述反应液即为cDNA，－80 ℃保存。3）PCR 反应：cDNA作为荧光定量模板，反应体系2×SYBR Green mixture 5 μL、10 μmol/L 正向引物（见表1）1μL、10μmol/L 反向引物（见表1）1 μL、cDNA 1 μL、去RNA 酶水2 μL，反应条件为95 ℃2 min，95 ℃5 s、60 ℃10 s，共40 个循环。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司设计（见表1），计算方法为2－ΔΔCt。

表1 实时荧光定量PCR 引物

2．5 统计学方法 实验过程中各组均有大鼠死亡的情况发生，但存活数均在10 只以上，为方便统计每组均取10 只大鼠的实验数据进行统计学分析。采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析，采用“均数±标准差（）”描述连续型变量，多组均数比较使用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义，P＜0.01 表示差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1 寒哮大鼠治疗后症状的变化 灌胃给药后，药物组大鼠症状较模型组有明显好转，其中平喘宁高剂量组大鼠症状改善最为明显，其呼吸急促状况缓解，腹部节律收缩不明显，咳嗽、流清涕较前改善，精神好转，活动度提高，畏寒、大便溏症状消失，食欲正常。

3.2 各组大鼠肺组织病理变化比较 病理结果见图1，正常组大鼠支气管周围炎性细胞浸润不显，支气管管壁及肺泡保持完整，未见平滑肌增生，未见支气管增厚，管腔内未见粘液栓及脱落的肺泡上皮，而光镜下观察到模型组大鼠支气管结构发生改变，周围黏膜组织发生水肿，多种炎性细胞浸润明显，可见粘液栓及脱落的支气管上皮细胞，支气管周围平滑肌增生明显，黏膜褶皱增多，管腔出现狭窄。除正常组外的其余5 个药物组大鼠通过灌胃给药后，对比模型组大鼠可以观察到，药物组大鼠病理改变都有不同程度的好转，并且平喘宁高剂量组对气道改善程度优于其余个药物组。

图1 各组大鼠肺组织HE 染色（10×40 倍）

3.3 各组大鼠肺组织ASK1、TSC1 表达水平比较相较于正常组，其余6 组ASK1 的表达量均上升，并且P 值均有统计学意义见表2，并且模型组中的ASK1 表达量上升最为显著（P＜0.01）。除正常组外，其余五个药物组相对比于模型组，ASK1 的表达量均有所下调（P＜0.01）；平喘宁高、中剂量组中ASK1 的表达量较地塞米松组与桂龙咳喘宁组下降明显（P＜0.01），其中以平喘宁高剂量组最为显著（P＜0.01）；而在平喘宁高中低三个剂量组内相比较而言，平喘宁高剂量组对ASK1 表达量的下调优于中剂量组（P＜0.01），中剂量组又优于低剂量组（P＜0.01）。

并且通过表2 可以看出，TSC1 的表达量，相较于正常组，其余6 组TSC1 的表达量均有所下降，并且P值均有统计学意义，尤其是模型组中的TSC1 表达量下调最为明显（P＜0.01）。除正常组外，其余五个药 物治疗组相与模型组相比，TSC1 的表达量均有所上升（P＜0.01）；平喘宁高剂量组对TSC1 的表达量的上调优于地塞米松组与桂龙咳喘宁组（P＜0.01），而此二组对TSC1 表达量上调又高于平喘宁中、低剂量组（P＜0.01）；而在平喘宁高中低3 个剂量组内相比较而言，平喘宁高剂量组对TSC1 表达量的上调明显大于中、低剂量组（P＜0.01），而中剂量组对TSC1 的影响又高于低剂量组（P＜0.01）。

表2 7 组大鼠肺组织中ASK1、TSC1 表达丰度（s，n=10）

表2 7 组大鼠肺组织中ASK1、TSC1 表达丰度（s，n=10）

注：同正常组比较，##P＜0.01；同模型组比较，△△P＜0.01

4 讨论

哮喘是最常见的慢性病之一，是由细胞组分和多种细胞（如嗜酸粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、T 淋巴细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞）参与的气道慢性炎症性疾病，其以气道高反应性（airway hyperresponsive-ness，AHR）、气道重塑（airway remod-eling）、支气管炎症、气道阻塞以及不稳定的支气管舒缩状态为主要特征[8-9]。中医认为哮病的病理因素以“痰”伏藏于肺中为基础，其中的伏痰是发为哮病的“夙根”。

平喘宁方主要由解表药联合止咳平喘药，外加补虚等药构成，以达到温肺化痰降气、止咳平喘补虚之功效，主治素体虚弱伏痰内蕴，加之外感风寒，内外合邪，痰气相搏，肺失宣降的寒哮。方中共有11 味中药：麻黄、细辛、半夏、苏子、苦杏仁、陈皮、浙贝母、防风、地龙、黄芪、太子参。方中麻黄宣肺散寒平喘，细辛温肺化饮，两者合用为君药；苦杏仁、苏子降气止咳平喘，与麻黄合用可以恢复肺气之宣降，半夏化痰与苦杏仁相伍，可以加强化痰止咳之效，地龙的使用可以舒缓支气管痉挛状态，以上4 味共为臣药；陈皮与半夏配伍，达到顺理肺气，气顺痰消的目的，浙贝母[9-10]现代药理学发现其可以抗炎、舒张气道平滑肌以及抑制细胞增殖，而黄芪、防风两药合用取自玉屏风散的益气固表之意、太子参补脾土，3 药合用能培土生金扶助正气，加快肺功能的恢复，协助提升君药臣药的效果，以上5 味为佐药；且地龙性善走窜经络亦可平喘，能够协助诸药对寒哮的治疗，发挥使药的作用。

PI3K/Akt 信号通道是人体内十分重要的信号转导通道，其在调控细胞存活、代谢、增殖及凋亡中发挥着重要作用[11-12]。研究显示PI3K/Akt 信号通路与哮喘的关系十分密切，其通过影响气道平滑肌细胞（ASMC）的增殖、干预炎症细胞及影响气道黏液的分泌，在支气管哮喘发病机制中起着重要作用[13-14]。有报道表明ASK1（Apoptosis signal regulating kinase 1）是细胞丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAP3Ks）家族成员之一，当受到外界刺激时可以选择性的激活c-Jun 氨基末端激酶（C-Jun N-terminal kinase，p-JNK），诱导细胞的凋亡[15-16]；同时它也是Akt 激酶底物，研究显示，Akt激酶可以磷酸化ASK1 的Ser83，从而抑制ASK1 的活化，进而抑制细胞的凋亡[17]，并且ASK1 的活化，可以刺激炎性细胞反应，分泌炎性介质，损伤肺组织[18]。研究显示，TSC1/2 复合体位于PI3K-Akt 的下游，但处于mTOR 的上游，Akt 的磷酸化可以通过抑制TSC1/TSC2 的活性来激活mTOR，进而对细胞增殖产生影响，并且单独的TSC1 对细胞的增殖依然具有调节作用[19-20]，并且有报道称TSC1 表达量的升高有助于抑制人胚肺成纤维细胞的增殖与分化，对肺纤维化起到抑制作用[21]。

本实验结果显示，平喘宁能够通过调节PI3KAkt 信号转导通路中的ASK1、TSC1 的表达，进而降低气道炎症及气道高反应性，对平滑肌增殖起到抑制作用，从而实现改善气道重塑达到治疗哮喘的目的。