加压提取法制备盾叶薯蓣根茎中薯蓣皂苷元

杨鹏飞，朱烨婷，方 旭，钱银环，夏国华，于欣茗，杨 欢，沈玉萍∗

（1.常州市金坛区人民医院，江苏 常州214000；2.江苏大学药学院，江苏 镇江212013；3.镇江市中医院药剂科，江苏 镇江212003）

薯蓣皂苷元又名薯蓣皂素，是医药工业中用于合成激素类药物的重要原料，被誉为“激素之母”，我国年产量为3 000～4 000吨，约占全世界年需求总量的70%［1］。近年来对该甾体类化合物生物活性的研究比较广泛，发现它具有抗肿瘤［2］、提高认知功能［3］、缓解神经病理性疼痛［4］、保护甲亢性肝损害［5］等药理作用，并能通过抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶等来产生降血糖效果［6-7］，抑制甲状腺细胞增殖，缓解甲状腺肿大［8］，在相关新药开发方面展现了巨大的潜力。

盾叶薯蓣Dioscorea zingiberensisC.H.Wright 为薯蓣科薯蓣属多年生草本植物，是世界上薯蓣皂苷元含有量最高的薯蓣品种。我国是其原产国，《山海经》 中即有相关记载，长期以来在湖北等省份大面积种植，其根茎年产量大，是目前在工业实践中用于生产薯蓣皂苷元的主要原材料［9］。

盾叶薯蓣根茎制备薯蓣皂苷元主要采用3种方法［10-13］，即直接酸水解法、索氏抽提-常压酸水解法、双相联合酸水解法。但由于该部位淀粉、纤维素含有量丰富，故常需使用高浓度无机酸［14］，导致薯蓣皂苷元发生脱水、异构化等副反应；索氏抽提法消耗时间长，效率低；常压下反应温度较低，导致薯蓣总皂苷水解不彻底，使得其得率偏低。本实验采用加压提取法从盾叶薯蓣根茎中得到薯蓣总皂苷，再以加压双相酸水解技术制备薯蓣皂苷元，与其他3种提取方法相比，具有耗时短、硫酸消耗量低、得率高等优点，值得推广应用。

1 材料

AE240电子分析天平（0.01 mg），购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Alpha 1-2 LD 冷冻干燥机，购自德国Christ 公司；RZ6二级旋片真空泵，购自德国VacuuBrand 公司；GSH-0.5加压反应釜（内胆PTFE 覆膜），购自威海坤昌化工有限公司；RHP-800高速多功能粉碎机，购自浙江永康荣浩工贸有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪（1 L），购自上海亚荣生化仪器厂；Prominence 20AVP 高效液相色谱系统，由DGU-20A 脱气机、LC-20AT 高压泵、CTO-10AC 柱温箱、FCV-10AL 混合器、SPD-20 A 紫外／可见光检测器组成，购自日本Shimadzu 公司；N2000 SP1色谱工作站，购自浙江大学智达信息工程有限公司。

薯蓣皂苷元对照品（批号20120828，含有量≥98%），购自上海金穗生物科技有限公司。PTFE 针头式微孔滤器（13 mm，0.22 μm），购自美国Thermo Fisher Scientific 公司。乙腈为色谱纯，购自美国OmniGene LLC 公司；浓硫酸、无水乙醇、石油醚（90～120 ℃）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水（＞18.2 MΩ·cm）由Millipore MilliQ Biocel 纯水机制备。

盾叶薯蓣根茎于2017年10月采自湖北省十堰市，经镇江市中医药药剂科孙小祥副主任中药师鉴定为正品，洗净泥土后切片，冷冻干燥，粉碎后过40目筛，收集细粉，置于电子干燥箱（相对湿度＜40%）中保存。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［15］Waters XBridge Shield RP18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（70 ∶30）；分析时间15 min；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长202 nm；进样量为20 μL。

2.2 线性关系考察 精密称取薯蓣皂苷元对照品15.50 mg，无水乙醇溶解并定容至10 mL，摇匀，配制成1 550 mg／mL 贮备液，二倍稀释法依次稀释成775.0、387.5、193.8、96.88、48.44、24.22、12.11 μg／mL 对照品溶液，0.22 μm 针头式微孔滤器过滤，弃去初滤液，续滤液在“2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y=8 482.7X＋23 728.0（R2=0.999 9），在12.11～1 550 μg／mL范围内线性关系良好。

2.3 加压提取法制备 精密称取药材粉末10.00 g，与一定体积乙醇混合后在加压反应釜中提取一段时间，提取液减压回收乙醇后进行加压双相酸水解，即加入200 μL 浓硫酸定容至50 mL，再加入等量石油醚，于150 ℃下加压水解2.0 h，其间100 r／min 持续搅拌，分取石油醚层，水洗至中性，减压回收溶剂至干，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，滤过，测定薯蓣皂苷元得率。

2.3.1 温度 考察了温度120～150 ℃对薯蓣皂苷元得率的影响，结果见图1。由图可知，当温度从120 ℃升高到130 ℃时，薯蓣皂苷元得率从2.80% 增加到3.27%；进一步增加至150 ℃时，得率反而略有下降，故选择温度为130 ℃。

2.3.2 料液比 考察了料液比1 ∶10～1 ∶50对薯蓣皂苷元得率的影响，结果见图1。由图可知，当料液比从1 ∶10升高到1 ∶20时，薯蓣皂苷元得率从3.27%增加到3.46%；进一步增加至1 ∶50时，得率变化不大，综合考虑保证充分提取和减少溶剂用量，选择料液比为1 ∶20。

2.3.3 乙醇体积分数 考察了乙醇体积分数40%～70%对薯蓣皂苷元得率的影响，结果见图1。由图可知，当乙醇体积分数从40% 升高到60% 时，薯蓣皂苷元得率明显增加，在60%时达到3.56%；进一步增加至70%时，得率反而有所下降，故选择乙醇体积分数为60%。

2.3.4 提取时间 考察了提取时间0.5～4.0 h 对薯蓣皂苷元得率的影响，结果见图1。由图可知，当提取时间为2 h时，薯蓣皂苷元得率较高，达3.56%；进一步延长时，得率反而略有下降，故选择提取时间为2 h。

图1 提取温度（A）、料液比（B）、乙醇体积分数（C）、提取时间（D）对薯蓣皂苷元得率的影响

2.4 直接酸水解法制备 精密称取药材粉末10.00 g，加入2.0 mol／L 硫酸200 mL，沸水浴中回流水解4 h，倾出，饱和石灰水中和，滤过，蒸馏水洗涤滤渣，80 ℃烘干后加入石油醚，索氏抽提24 h，减压回收溶剂至干，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，滤过，测定薯蓣皂苷元得率。

2.5 索氏抽提-常压酸水解法制备 精密称取药材粉末10.00 g，加入甲醇，索氏抽提24 h，减压回收溶剂至干，加入2.0 mol／L 硫酸200 mL，沸水浴中回流水解4 h，倾出，冷却后用石油醚萃取，分取石油醚层，水洗后减压回收溶剂至干，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，滤过，测定薯蓣皂苷元得率。

2.6 双相联合酸水解法制备 精密称取药材粉末10.00 g，加入含6%硫酸的20%甲醇、石油醚各200 mL，沸水浴中回流萃取8 h，滤过，收集滤液，分取石油醚层，水洗后减压回收溶剂至干，残留物以无水乙醇溶解并定容至100 mL，滤过，测定薯蓣皂苷元得率。

2.7 指标计算 将按“2.3”～“2.6”项下方法制备的供试品溶液进行分析，计算薯蓣皂苷元质量浓度（C）、得率（Z）、变化率（I），公式为Z=C×100 mL／药材质量×100%、I=［（加压提取法-传统方法）／传统方法］×100%。

2.8 加压提取法与3种传统方法的比较 表1显示，加压提取法制备时薯蓣皂苷得率与双相联合酸水解法接近，并高于直接酸水解法、索氏提取-常压酸水解法，不仅硫酸消耗量大大降低，而且总耗时量也明显缩短。由此可知，该方法得率更高，耗时更少，更绿色环保。

表1 加压提取法与3种传统方法比较（n=3）

3 讨论与结论

直接酸水解、索氏抽提-常压酸水解等传统方法在对盾叶薯蓣根茎或其提取物以高浓度硫酸溶液进行长时间酸水解的过程中，经常发生消除（3-OH 与4-H 脱水）、构型转换（25S→25R）、开环（F 环）等副反应，而且会产生大量废水排放，对环境造成的负面影响较大。本实验利用由低浓度硫酸溶液和石油醚组成的双相溶液构筑酸催化反应体系，可减少产物与酸的接触，有效保护薯蓣皂苷元结构的稳定性，从而有助于提高得率。

同时，本实验优化了加压提取法从盾叶薯蓣制备薯蓣皂苷元的条件，即称取药材粉末10.00 g，与200 mL 60%乙醇混合后置入加压反应釜中，于130 ℃下提取2 h，提取液减压回收乙醇，加入200 μL 浓硫酸定容至50 mL，再加入50 mL 石油醚（90～120 ℃），于150 ℃下加压水解2.0 h，其间100 r／min 持续搅拌，分取石油醚层，水洗至中性，减压回收溶剂至干。与3种传统方法（直接酸水解法、索氏抽提-常压酸水解法、双相联合酸水解法）比较，该方法提高了薯蓣皂苷元的得率，并且使耗酸量大幅减少，而且操作简便易行，生产周期明显缩短，可为解决目前我国薯蓣皂苷元生产工艺存在的得率低、污染重、周期长等一系列问题提供新的研究思路。但本实验所得工艺研究尚处于实验室规模，还需开展中试放大试验进一步验证和优化相关参数，以期为工业实践奠定基础。