参麦注射液对阿霉素所致心肌炎症损伤的保护作用

潘星宇，杨 林，张 升∗

（1.海宁市第二人民医院，浙江 海宁314419；2.浙江省医学科学院，浙江 杭州310013）

阿霉素（Doxorubicin，DOX），又称多柔比星，是临床上广泛用于治疗各类恶性肿瘤的蒽醌类化疗药物。然而严重的剂量依赖性心脏毒副作用影响了阿霉素的临床使用空间［1-2］。阿霉素致心脏毒性的机制尚不完全清楚，传统研究认为，阿霉素的心脏毒性主要因为阿霉素在体内代谢后生成半醌自由基，进而接到氧自由基损伤心肌细胞［3］。而在近些年的研究中发现，阿霉素诱导的心肌组织炎症在阿霉素心脏毒性机制中发挥着重要的作用［4］。

参麦注射液（Shenmai Injection，SMI）源于参麦散名方，由人参、五味子、麦冬组成，经现代制剂工艺加工成的注射制剂。具有益气固脱，养阴生津的作用，现代药理学证明参麦注射液具有抗氧化应激和抗炎的作用［5-6］。临床上参麦注射液被广泛用于治疗心脑血管疾病，因此本实验通过研究参麦注射液拮抗阿霉素诱导的心肌炎症损伤来揭示参麦注射液的抗炎作用，并通过研究NF-κB 通路的变化揭示在参麦注射液的抗心肌炎分子机理。

1 材料

1.1 动物 SPF 级健康SD 大鼠，50只，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限责任公司供应。动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养于温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%的条件下。在整个试验期间，大鼠自由饮水，喂养60Co 辐照的全价营养颗粒饲料，由南京安立默科技有限公司生产供应。

1.2 试药 阿霉素由武汉远成共创科技有限公司生产，含有量为99%，批号20170723。参麦注射液购自于正大青春宝药业有限公司，批号1804205。IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 试剂盒产自武汉华美科技有限公司；p-NF-κB、NF-κB 一抗由CST 生产，β-actin 一抗、HRP 二抗购自于上海碧云天公司。

1.3 仪器 电泳仪为Bio-rad 垂直电泳槽；显影仪（上海勤翔科学仪器有限公司，ChemiScope）；生化仪（日本日立公司）；心脏超声检测系统（加拿大，Vevo 1100）。

2 方法

2.1 分组及给药 50只健康SD 大鼠，雌雄各半，随机分为正常组、模型组（15 mg／kg 阿霉素）及参麦注射液低、中、高剂量组（0.1、0.3、1 g／kg），每组10。对照组按1 mL／100 g 剂量于实验第1、3、5、7天分别给予生理盐水；模型组实验第1、3、5天给予等容量的生理盐水，于第7天给予阿霉素15 mg／kg；参麦注射液组于实验第1、3、5天给予不同剂量（0.1、0.3、1 g／kg）的参麦注射液，于第7天给予阿霉素15 mg／kg。所有组动物于静脉注射阿霉素72 h 后（实验第10天）麻醉做心脏超声检查。超声检查结束后腹主动脉收集各大鼠外周血用于血清心肌酶检测；血液收集后处死大鼠收集各组大鼠心脏备用。

2.2 心脏功能超声检测 各组动物检测时通过吸入3%浓度的异氟烷进入麻醉，继而以吸入1%浓度的异氟烷维持麻醉。动物麻醉后，背位固定，左胸前区脱毛待检。当大鼠心率趋于持续性、稳定性时开始检测，在进行超声过程中保持大鼠正常的生理状态。以高频探头进行定位，将探头至于左胸部，取胸骨旁短轴切面，置于二尖瓣腱索水平，M模式超声心动评价心脏运动，分别检测心率（HR）和心搏出量（CO），计算射血分数［EF（%）］。

2.3 血清生化学检测 各组大鼠外周血收集后，静止30 min 后，2 500 r／mim 离心15 min，收集上清。使用日立全自动血清生化仪检测血清中的心肌相关酶（AST、LDH、CK-MB）。

2.4 心脏组织中炎症因子检测 取各组大鼠心脏0.1 g，加入1 mL 生理盐水后匀浆，1 500 r／min离心后收集上清液。按试剂盒步骤进行ELISA测定。

2.5 炎症通路相关蛋白检测 各组大鼠剪取各心脏组织约0.1 g，加入RIPA 裂解液1 mL，组织匀浆机充分匀浆，裂解30 min 后，12 000g／mim 离心10 min，收集上清。采用BCA 法进行蛋白定量。总蛋白经SDS PAGE 分离后，转移到PVDF 膜上，5% 脱脂奶粉封闭1 h，分别加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日，用TBST 洗膜3次，使用TBST 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温孵育90 min，TBST 洗膜3次后用化学发光法显影，采用Image J 软件进行条带分析。

2.6 统计学分析 采用Excel 和SPSS 统计分析进行数据处理，计量资料用（）表示，组间比较采用单因素方差分析；多重比较用LSD 法，P＜0.05差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 参麦注射液对大鼠心肌功能的影响 正常组大鼠心脏大小正常，心肌厚度均一，心脏搏动有力、平稳，心包无积液，未见心房与静脉回流；模型组大鼠可见心室肌增厚，心脏搏动减慢且出现搏动不规律，偶见静脉回流；参麦注射液组大鼠心肌增厚现象消失，心脏搏动恢复正常，未见心包积液或静脉回流。与正常组比较，模型组大鼠心率、心搏出量、射血分数显著降低（P＜0.01）；参麦注射液（0.3、1 g／kg）组大鼠心率、心搏出量、射血分数显著上升（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

3.2 参麦注射液对大鼠血清心肌酶的影响 与正常组比较，模型组心肌酶指标（AST、LDH、CKMB）水平显著上升（P＜0.01）。与模型组比较，参麦注射液高剂量组心肌酶指标水平显著下降（P＜0.05，P＜0.01）；中剂量组LDH、CK-MB 水平均显著下降（P＜0.05）。见表1。

表1 参麦注射液对大鼠血清心肌酶的影响（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

表1 参麦注射液对大鼠血清心肌酶的影响（， n=10）Tab.1 Effects of SMI on myocardial serum enzymes in rats（， n=10）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

图1 参麦注射液对大鼠心肌功能的影响（n=10）Fig.1 Effects of SMI on myocardial function in rats（n=10）

图2 参麦注射液对大鼠心肌组织中炎症因子的影响Fig.2 Effects of SMI on myocardial inflammatory factors in rats

3.3 参麦注射液对大鼠心肌炎症因子的影响 图2表明，与正常组比较，模型组大鼠心脏组织中促炎因子IL-6、TNF-α 水平显著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10水平显著下降（P＜0.01）。与模型组比较，参麦注射液高剂量组能显著逆转以上炎症因子水平（P＜0.05，P＜0.01）；而参麦注射液低、中剂量组能明显上调IL-10水平（P＜0.01）。

3.4 参麦注射液对大鼠心肌组织NF-κB 磷酸化的影响 与正常组比较，模型组p-NF-κB 蛋白表达明显升高（P＜0.01）；经参麦注射液干预后，给药组大鼠心脏组织内p-NF-κB 蛋白表达显著降低（P＜0.01）。见图3。

4 讨论

阿霉素作为蒽醌类药物，具有广谱的抗肿瘤活性，但也同时因为存在急性、亚慢性和慢性的心脏毒性使临床使用受限［8］。参麦注射液源于《病因脉治》 中的参冬饮。主要用于益气固脱，养阴生津，生脉。用于治疗气阴两虚之冠心病、病毒性心肌炎和慢性肺心病。参麦注射液是中国传统医学与现代制剂工艺结合产生的中药注射剂，临床上用于治疗心血管疾病。同时参麦注射液能够提高肿瘤病人的免疫机能，与化疗药物合用时有增效作用，因其自身也具有一定的抗肿瘤活性，在临床上常用于抗肿瘤的辅助用药［7］。本研究也验证了参麦注射液联合化疗药物使用时能够保护心脏组织，为中医药临床研究提供了临床前实验数据，指导临床对参麦注射液的开发使用。

图3 参麦注射液对大鼠心肌组织p-NF-κB 蛋白表达的影响（n=10）Fig.3 Effects of SMI on the expression of p-NF-κB protein in rat myocardia（n=10）

阿霉素诱导的心脏毒性机制具有多样性的特点，尚未完全明确。一般认为氧化应激是阿霉素心脏毒性的主要毒理机制，而其他如细胞代谢异常，损伤细胞线粒体和炎症反应也被视为阿霉素诱导心肌损伤的重要因素［9］。事实上，临床中发现阿霉素的使用能够激活机体固有免疫，释放炎症因子导致心脏病理性改变［10］。参麦注射液通过提高机体免疫功能，降低炎症因子的释放，改善心肌组织炎症反应保护心肌组织［11］。本实验一次性注射给予15 mg／kg 阿霉素造成大鼠急性心脏毒性，心肌组织中IL-6和TNF-α 等促炎因子升高和IL-10抗炎因子降低。IL-6和TNF-α 可通过增加中性粒细胞和吞噬细胞的功能，激活大量的过氧化物阴离子，从而引发自由基攻击细胞膜及其细胞器的磷脂膜，导致心肌细胞损伤。又由于心肌细胞本身不具有再生的功能，心肌细胞损伤容易诱发心脏收缩和舒张障碍，心率（HR）下降，心肌泵血能力（CO、EF）降低等心脏功能异常。在大鼠外周血血清中检测到AST、LDH 和CK-MB 等心肌酶升高也证实了阿霉素的急性损伤作用。而提前给予参麦注射液的大鼠，上述症状均有显著改善，且部分指标具有剂量依赖性。参麦注射液能够通过减少炎症反应，保护心肌细胞，恢复心肌功能来拮抗阿霉素诱导的心脏毒性。

NF-κB 信号通路是细胞内最为重要的炎症诱导分子通路。使促炎因子TNF-α 和白介素等胞外信号均能引起NF-κB 通路的激活的激活。NF-κB 蛋白是调控细胞炎症的关键转录因子，其P65亚基的磷酸化是NF-κB 激活的标志［12］。本研究发现，大鼠给予阿霉素72 h 后，心脏组织内NF-κB 的磷酸化程度升高，提示NF-κB 信号通路激活。参麦注射液能够通过降低阿霉素升高的p-NF-κB，阻断NF-κB 信号通路启动，减少炎症的产生，提示参麦注射液的抗炎作用与抑制NF-κB 通路有关。此外，NF-κB 信号通路的激活对肿瘤的转移具有明显的促进作用［13］，参麦注射液能抑制阿霉素升高的NFκB 磷酸化，也提示了参麦注射液能够有效辅助阿霉素治疗肿瘤的恶性转移。

综上所述，参麦注射液能够有效的拮抗阿霉素诱导的心肌损伤，且这种保护作用体现在抑制阿霉素诱导的心肌炎症的产生，保护心肌功能，并调控NF-κB 信号通路抑制细胞内炎症通路的激活。因此，参麦注射液在临床上能够作为阿霉素抗肿瘤的辅助用药。