DRD2 基因多态性对伏隔核功能连接影响的性别特异性研究

赵芳石 张雪君

多巴胺受体（dopamine receptor D2，DRD2）基因rs1076560 位点多态性可以通过调控多巴胺浓度，进而调控多巴胺对大脑认知的影响。DRD2 可参与奖赏行为，与酗酒、药物依赖、毒品依赖等与奖赏有关的疾病显著相关[1-2]。伏隔核作为奖赏中心，奖赏行为依赖于伏隔核与全脑连接的系统作用来实现[3]。但目前尚未见DRD2 基因多态性调控伏隔核的功能连接（functional connectivity,FC）方面的研究。因此，本研究旨在探索DRD2 基因多态性对伏隔核FC 的影响， 以及DRD2 基因多态性对于不同性别伏隔核FC 的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 天津医科大学总医院于2015 年3—8 月前瞻性招募323 名健康青年志愿者，经筛查共排除43 名被试，其中23 名影像质量不佳，20 名被试基因数据不全。最终纳入280 名，年龄20～33 岁，平均（22.7±2.4）岁；其中男性132 名，女性148 名。纳入标准：①体健，右利手；②年龄20～33 岁，性别不限；③汉族；④无精神及神经系统疾病；⑤无脑创伤史、药物和乙醇依赖史；⑥无可能影响脑结构与功能的疾病且T2WI 筛查脑部显示正常； ⑦无MRI 检查禁忌。排除标准：①影像质量不佳；②基因数据不全； ③量表数据不合格。本研究经天津医科大学总医院医学伦理委员会批准， 被试均签署书面知情同意书。

1.2 行为学测评 应用三维人格问卷[4-5]进行人格维度评定，将人格分为3 个相互独立的维度：奖赏依赖（reward dependence,RD）、猎奇性、伤害避免，采用其中的RD 量表评测奖赏行为并记录RD 分数 （0～30 分）。分数越高，说明其对奖赏刺激反应的依赖程度越高。

1.3 基因型测定 取外周血3 mL， 利用EZgeneTM血液gDAN 小量提取试剂盒提取基因DNA，用于检测DRD2 rs1076560 位点C/A 等位基因多态性[6]。该基因型分析得到上海Biowing 应用生物技术公司的技术支持。首先设计不同的特异性引物进行扩增反应，获得含有待检测突变位点的基因片段。DRD2 的聚合酶链反应 （PCR） 引物序列为5’AGCATCTCCATCTCCAGCTC3’,反向：5’GAAAAAGGACAGGGGCAATC3’。经过PCR、连接酶检测反应、测序电泳实验及数据分析与位点读取， 获得每名被试的基因型， 根据基因型将被试分为T 基因携带组和GG 纯合子组。

1.4 MRI 数据采集及处理

1.4.1 数据采集 采用GE 3.0 T Signa HDx MR 扫描设备，8 通道头线圈，成像范围覆盖全脑。被试仰卧位， 固定头部并处于静息状态。采用单次激发回波平面成像序列行横断面静息态fMRI 扫描，扫描参数：TR/TE=2 000 ms/30 ms，FOV=240 mm×240 mm，矩阵=64×64，层厚=4.0 mm，无间距，层数40，采集180 个时相。

1.4.2 数据处理 采用Matlab 的SPM12（Statistical Parametric Mapping，SPM，http：//www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm）及DPARSFA（Data processing assistant for resting-atate fMRI advanced edition，DPARSFA，http：//www.restfmri.net/forum/） 进行功能MRI 数据预处理及分析[7]。主要步骤：①剔除前10 个时相图像，共170 个时相数据用于预处理；②时间校正；③头动校正（剔除三维平移超过2 mm 或者三维旋转角度超过2°的被试）；④空间配准；⑤去除协变量，包括脑脊液信号、白质信号、头动参数及全脑信号；⑥带通滤波，去除0.01～0.08 Hz 范围内的低频及高频噪声；⑦空间平滑（高斯核半高全宽为6 mm×6 mm×6 mm）。

图1 双侧伏隔核种子点模板，图中彩色区域分别代表两侧伏隔核。

1.4.3 种子点选区和FC 分析 选用Harvard-Oxford 模板中50%的概率模板， 提取双侧伏隔核作为种子点（图1）。基于种子点（双侧伏隔核）与全脑进行FC 分析。主要步骤如下：①计算双侧伏隔核内所有体素的时间序列值及其平均值； ②计算伏隔核平均时间序列值与全脑灰质体素时间序列值之间的相关系数；③将影像进行Fisher’s z 变换，获得每个体素的FC 值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，连续变量2 组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例表示，分类变量2 组间比较采用χ2检验。应用Matlab 的SPM12 软件，以年龄及受教育年限作为协变量， 采用独立样本t 检验对DRD2 两组基因型的伏隔核与全脑FC 值进行比较， 并分别在男性和女性被试中对DRD2 两组基因型的伏隔核与全脑FC 值进行比较。该结果需要采用DPABI 软件中的AlphaSim 校正进行多重比较校正（体素水平P=0.01，迭代次数5 000 次，团块水平P<0.05），校正后得到的脑区为差异脑区。提取有差异脑区的FC值，将其与全部被试的RD 分值进行Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料及RD 分值比较 DRD2 rs1076560 基因T 等位基因携带组与GG 纯合子组的年龄、性别、受教育年限、RD 分值比较，其差异均无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 2 组被试一般资料及RD 分值比较

2.2 2 组间伏隔核与全脑FC 分析 2 组被试间双侧伏隔核与全脑FC 值的差异均无统计学意义（P>0.05）。女性被试的2 组间伏隔核与全脑FC 值的差异也无统计学意义（P＞0．05）。男性被试中，T 等位基因携带组与GG 纯合子组相比， 前者左侧伏隔核与双侧前扣带FC（AlphaSim 校正，t=-2.937，P=0.004）、右侧伏隔核与双侧前扣带（AlphaSim 校正，t=-3.744，P<0.001）和左侧腹内侧前额叶FC 均减低（AlphaSim校正，t=-2.667，P=0.009）（表2，图2）。

表2 男性中的2 组被试的左右伏隔核与全脑FC 的结果

2.3 相关性分析 提取3 个差异区FC 值后，与RD评分无显著相关性 （r=0.305，P=0.091；r=0.099，P=0.146；r=0.373，P=0.079）。

3 讨论

3.1 多巴胺基因多态性与奖赏 多巴胺作为脑内重要神经递质之一参与调控奖赏依赖性、 奖赏敏感性、奖赏反应性特质等行为。DRD2 基因多态性可以通过细胞信号转导偶联来调控多巴胺递质的功能[8]。多巴胺DRD2 rs1076560 基因型有G 和T 两型，该基因可以调控DRD2 长型L、短型S 比率，其中G 基因型使S 型高表达，T 基因型使L 型高表达。由于DRD2 的S 型可以抑制多巴胺的释放， 因此T等位基因携带者的脑内多巴胺浓度要高于GG 纯合子[9]，这就使携带不同基因型的人脑内的多巴胺受体功能及多巴胺浓度不同， 进而导致人脑对奖赏系统调控的个体差异。

3.2 多巴胺基因与伏隔核 伏隔核与选择性注意、奖赏、 记忆等行为过程有关， 是情绪到行为的调控站， 在将情绪转化为意念性行为的过程中起重要作用， 一切天然的奖赏性刺激都是由于最终引起伏隔核内多巴胺释放增多，从而产生奖赏效应。有研究[10]表明伏隔核中多巴胺受体可以有效产生药物强化作用， 从而导致药物成瘾。在网瘾研究中发现网瘾病人腹侧被盖区-伏隔核通路的功能和结构连接的异常[11]。因此，多巴胺系统与伏隔核结构和功能在奖赏及成瘾中起重要的作用。

图2 男性双侧伏隔核FC 在DRD2 不同基因型2 组间存在差异的脑区。A-C 图中彩色区域为组间FC 值差异脑区，背景图像为MNI 模板脑，彩条代表FC 值的组间有统计学差异的t 值。a-c 图为对应差异脑区的2 组基因型FC 值的条形图，* 表示P＜0.05 两组间FC 值差异有统计学意义。

3.3 DRD2 基因多态性对伏隔核FC 的影响存在性别特异性 FC 能够反映大脑各个脑区在时间上的相关性， 表示在执行某种功能时不同脑区之间具有协同作用，这种协同作用为行为提供指导基础，此研究方法已广泛应用于神经及精神疾病的研究中，为诊断及治疗提供了解剖依据[12]。基于FC 技术的成熟，我们探索了T 等位基因携带组与GG 纯合子组间在伏隔核与全脑FC 的差异性， 在本研究的全部被试中，DRD2 rs1076565 两组基因型的双侧伏隔核与全脑FC 值间的差异无统计学意义，与以往研究[1-2]发现的DRD2 rs1076565 T 等位基因可以增加奖赏相关的成瘾性疾病风险这一结论不一致， 这可能与DRD2 受体在男性与女性中表达差异以及雌激素影响有关[13]。本研究结果可能与性别的混杂因素相关，因此我们进一步分析了在不同性别中DRD2 两组基因型间双侧伏隔核与全脑FC 值的差异。

本研究发现仅男性被试者的T 等位基因携带者在双侧伏隔核与前扣带及腹内侧前额叶FC 显著减低。而女性中DRD2 基因多态性组间伏隔核FC差异没有统计学意义， 这与DRD2 受体在男性与女性中表达差异及在DRD2 奖赏及成瘾疾病研究中性别特异性的研究结果一致[14]。前扣带参与认知控制及奖赏决策，参与奖赏价值的学习，也参与赌博任务的奖赏。腹内侧前额叶既负责认知行为， 又参与奖赏行为。伏隔核与前扣带及前额叶连接也归为奖赏评估网络，负责立刻执行奖赏行为的网络。研究[15]表明海洛因依赖的病人中伏隔核与前扣带FC 有改变。本研究表明T 等位基因携带者的奖赏评估网络的连接减低，尤其伏隔核与前扣带、前额叶连接，提示在早期奖赏中枢连接的异常，这为男性T 基因携带者患乙醇依赖、 药物依赖等成瘾性疾病的风险性显著增高提供影像学的依据。

3.4 局限性和展望 本研究没有发现伏隔核FC 改变与奖赏行为量表之间的相关性， 可能由于基因型差异只引起了脑功能连接的改变， 还未引起行为学的改变。另外，由于单个SNP 对脑结构及功能本身效应比较微弱，本研究校正阈值（P 值）设置相对于疾病的研究还不够精准， 因此有待今后增大样本进一步研究来确认。今后还可以进行任务态功能连接的MR 研究，分析奖赏行为对奖赏网络的影响，能更深入理解多巴胺基因与伏隔核FC 的关系。