陆地棉 GhRab7基因鉴定及酵母中盐胁迫响应分析

刘凌云，李玉龙，王艳霞，李秀文，张 彤

(河南大学 生命科学学院，河南开封 475004)

Rab蛋白是一类分子质量为20～30ku、在真核生物中广泛存在的GTP结合蛋白，该类蛋白不仅通过调节囊泡的形成、运输和锚定等行为参与胞内膜系统融合过程，而且也作为信号分子参与调节各种生长发育及胁迫响应过程[1-3]。在这些Rab蛋白中，Rab7(RabG)相关蛋白负责调节内吞物质转运到溶酶体降解的过程[4]。

值得注意的是，已经发现一些Rab7基因对干旱、盐、低温、脱落酸(ABA)、病菌等环境刺激发生响应。干旱和ABA强烈上调水稻OsRab7的转录，盐胁迫时超表达OsRab7的转基因水稻根尖液泡数量增多，脯氨酸含量增加[5]。水杨酸及病原菌均能诱导拟南芥AtRab7(RabG3e)的表达，超表达AtRab7转基因拟南芥内吞过程加快，盐和渗透胁迫耐性增加，活性氧积累减少[6]。狼尾草PgRab7转录明显受盐、冷、干旱及IAA的诱导，超表达PgRab7的转基因烟草随着碱性磷酸酶活性增加，其对盐和甘露醇的抗性也增加[7]。此外，干旱、盐及ABA分别调节獐毛属AeluropuslagopoidesAlRab7的表达，异源表达AlRab7的大肠杆菌在分别含有盐、甘露醇、ABA及IAA的培养上生长更好[8]。这些研究结果暗示Rab7基因在植物中参与逆境胁迫尤其是盐胁迫响应的功能可能是保守的。

土壤盐分(NaCl)过度积累严重威胁作物的产量[9]，盐胁迫影响植物种子萌发、营养及生殖生长等过程。棉花(GossypiumhirsutumL.)属于中度耐盐作物，但种植地土壤的盐碱化严重影响其产量和品质。2015年陆地棉参考基因组序列的发表，使通过棉花功能基因的研究改良棉花种质以适应严苛的环境条件变得更加高效和方便[10]。转录组学研究剖析了棉花参与盐胁迫响应的各种组分[11]。此外，发现棉花GhZFP1(zinc finger protein1)转基因烟草盐胁迫耐性增强[12]；拟南芥中超表达棉花GhCIPK6(calcineurin B-like(CBL)-interacting protein kinase6)也表现出耐盐和耐旱特征[13]，但棉花耐盐的详细机制依然不清楚。本研究从陆地棉基因组中鉴定到一个Rab7类基因，命名为GhRab7。结果表明，GhRab7编码207个氨基酸组成的一个小G蛋白，该蛋白具有典型的Rab类蛋白保守基序。酵母中异源表达GhRab7基因，表现出不耐盐胁迫的特征；结合GhRab7启动子序列含有多个盐胁迫响应元件的结果分析，认为GhRab7可能在陆地棉应对土壤盐胁迫响应过程中发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 植物材料的培养

将纱布包裹的陆地棉(Gossypiumhirsutumacc. TM-1)种子浸湿后放入培养皿中，置于 25 ℃培养箱催芽。萌发后的幼苗移植于土壤：蛭石体积比为1∶1的培养钵内，在16 h光/8 h暗， 26 ℃白天/20 ℃晚上的条件下长至第二片真叶出现。取真叶用锡箔纸包裹，液氮速冻备用。

1.2 陆地棉 GhRab7基因的鉴定和分析

从棉花功能基因组数据库(https://cottonfgd.org/)中搜索并下载Rab7相关基因，通过ExPASy在线程序(http://web.expasy.org/)对相应基因编码蛋白的分子质量进行预测；分别用MEGA X和DNAMAN软件进行系统进化树构建(邻接法，Bootstrap重复次数设定为1 000)和氨基酸序列保守性及同源性分析；选取GhRab7基因起始密码子ATG上游2 000 bp序列通过PLACE网站(https://sogo.dna.affrc.go.jp/)进行植物盐胁迫响应顺式作用元件预测与分析。

1.3 GhRab7-pYES2表达载体的构建

利用TRIzol试剂(Invitrogen公司)提取陆地棉幼苗真叶总RNA，用M-MLV反转录试剂盒(Promega公司)反转录成cDNA。PCR扩增出624 bp的Gh_A13G0304(GhRab7)CDS序列，通过TA克隆连入pGEM-T载体(Promega公司)中，测序正确后，采用KpnI和XbaI(Takara公司)双酶切方法将GhRab7编码序列重组入酵母表达载体pYES2。PCR扩增所用引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)为5′-CCCGGTACCATGCCATCTCGCCGTAGAAC-3′和 5′-GGGTCTAGATCAACAGTCACATCCAGTTG-3′。

1.4 酵母转化及盐胁迫分析

通过醋酸锂方法[14]分别将pYES2空载体和GhRab7-pYES2重组载体转化入INVSC1酵母细胞并用缺乏尿嘧啶的SC培养基(SC-U培养基，购自北京泛基诺生物公司)筛选阳性克隆。然后将不同酵母株系阳性克隆在含有w=2%乳糖(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)的SC-U培养基中震荡培养12 h，菌液OD600调整至1.0，按照1∶1、1∶10、1∶100、1∶1 000、 1∶10 000的体积比稀释后取1 μL点到NaCl(200 mmol/L或300 mmol/L)+YPD培养基(20 g/L葡萄糖，20 g/L胰蛋白胨，10 g/L酵母提取物，20 g/L琼脂粉)上，将该培养基置于30 ℃培养箱培养，2 d后观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 陆地棉 GhRab7基因及蛋白的分子特性

为了解棉花Rab7基因的功能，以Rab7为关键词在陆地棉全基因组数据库(cottonFGD，陆地棉，南京农业大学组装及基因注释)中检索到24个标记为Ras相关蛋白Rab7的候选基因(表1)，除了将5个CDS长度仅有225～576个核苷酸，编码的氨基酸数低于200个的基因(Gh_A12G0832、Gh_D05G2587、Gh_D09G0431、Gh_D11G2824和Gh_Sca060638G01)在后续分析中予以舍弃外，余下19个潜在的Rab7基因CDS长度为615～702个核苷酸，编码氨基酸个数在204～233内，预测的蛋白质理论分子质量也在22.76～26.25 ku，符合Rab蛋白的典型特征[15]。陆地棉是异源四倍体，其基因组分别来源于二倍体亚洲棉和雷蒙德氏棉。进一步的分析也发现，这19个潜在的Rab7基因在陆地棉A基因组(10个)和D基因组(9个)分布不同，分别分布于2、3、5、9、10、12和13号染色体，暗示Rab7成员在陆地棉基因组进化过程中存在差异分化。

2.2 陆地棉GhRab7蛋白系统进化分析

为了解陆地棉Rab7蛋白的系统进化关系，对19个潜在的棉花Rab7蛋白与双子叶植物拟南芥AtRab7、单子叶植物水稻OsRab7一起进行了系统进化树的构建。结果显示，除个别蛋白外，大部分A基因组上编码Rab7蛋白的棉花候选基因可聚类到D基因组相应的位置，如A基因组9号染色体Gh_A09G0788与D基因组上9号染色体Gh_D09G0791聚为一类(图1)，由于陆地棉四倍体是由二倍体A和D基因组进化来的，因此这些结果进一步说明陆地棉可能同时具有A与D两套基因，同时不排除Rab7基因在进化过程中只保留一组二倍体基因的可能[16]。陆地棉Gh_A13G0304和Gh_D13G0342与拟南芥和水稻Rab7蛋白在系统进化树上位于同一个分支上，因此从进化关系来看，棉花这2个蛋白与拟南芥和水稻相应蛋白的亲缘关系都非常近，暗示它们在植物中可能具有类似的功能。

表1 陆地棉 GhRab7基因的分子特性Table 1 Molecular characterization of GhRab7 genes in upland cotton

图1 陆地棉GhRab7蛋白的系统进化分析Fig.1 Identification and phylogenetic analysis of Rab7 gene family in upland cotton

为进一步分析棉花与拟南芥、水稻Rab7蛋白间的关系，利用DNAMAN软件对这些基因编码的氨基酸序列进行了同源关系分析。结果显示，棉花同一个Rab7蛋白与拟南芥、水稻Rab7蛋白氨基酸序列同源性均非常相近，但不同棉花候选Rab7蛋白与拟南芥和水稻同源性为50.4%～76.8%，说明这些候选Rab7蛋白在进化过程中发生了分歧，在功能上可能会有所差异；同时也注意到，棉花Gh_A13G0304编码的蛋白与水稻和拟南芥一致性最高，分别达到76.8%和72%(图2)。这些结果均暗示Gh_A13G0304可能是要寻找的棉花Rab7基因，将其命名为GhRab7。

黑色框代表棉花中与拟南芥和水稻Rab7同源性最高的蛋白 Black box represents that upland cotton Gh_A13G0304 shares the highest amino acid sequence identity withArabidopisisand rice

图2 陆地棉与拟南芥、水稻Rab7蛋白同源性分析
Fig.2 The identify of Rab7 in upland cotton,Aradopsisand rice

2.3 陆地棉 GhRab7生理生化功能的预测

为探索棉花GhRab7可能的功能，首先对该基因编码蛋白进行序列保守性分析。通过与已知功能的拟南芥AtRab7和水稻OsRab7序列比对发现，棉花GhRab7含有5个典型的保守基序(G1-G5)(图3)，其中G1、G3、G4和G5是鸟苷酸结合区，涉及核苷酸的结合和水解过程；G1是磷酸及Mg2+结合位点，G2则是效应器结合区，G4和G5是GTP/GDP结合和水解的关键序列，该序列保守氨基酸突变会导致Rab蛋白组成型激活或失活[17]。而且，棉花GhRab7蛋白C-末端含有保守的Cys残基(图3)，该Cys残基与Rab蛋白的囊泡附着及蛋白功能密切相关[18]。这些结果暗示棉花GhRab7在生化上可能具有结合并水解GTP，参与囊泡转运及融合的功能。

“*”代表Rab7蛋白C-未端保守的Sys残基 “*” indicates a conserved Cys residue at the C-terminus of Rab 7 protein

图3 陆地棉与其他物种Rab7氨基酸序列保守性分析
Fig.3 Conserved motifs and their sequences in Rab7 proteins

鉴于多种Rab7基因参与了植物对盐胁迫的响应，选取GhRab7基因ATG上游2 000 bp序列，利用PLACE网站进行盐胁迫响应元件的分析。结果发现，GhRab7基因上游含有3种典型的盐胁迫响应元件：4个GT1GMSCAM4、4个DRECRTCOREAT和3个DRE2COREZMRA-B17顺式作用元件(表2)。此外，Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)在线预测GhRab7蛋白亚细胞定位结果显示，该蛋白定位于液泡内。说明在植物遭受盐胁迫时该蛋白可能通过介导囊泡转运将过多的Na+贮存于液泡来躲避盐毒害。

表2 陆地棉 GhRab7启动子序列盐胁迫响应元件分析Table 2 The cis-acting elements in responsive to salt stresses in GhRab7 promoter

2.4 酵母异源表达 GhRab7的盐响应分析

为证实棉花GhRab7基因响应盐胁迫的生理功能，构建了GhRab7-pYES2重组载体，并将其转入酵母细胞，在不同浓度NaCl处理下进行异源表达。如图4所示，在添加150 mmol/L NaCl的YPD培养基上，转pYES2空载的酵母细胞在稀释至10-4时依然能够生长，但转GhRab7基因的酵母细胞在稀释至10-1时生长已经明显受到抑制；同样，在300 mmol/L NaCl的YPD培养基上，转GhRab7基因的酵母细胞表现出相似的特征。这些结果表明GhRab7参与了盐胁迫响应过程。

图4 异源表达 GhRab7基因酵母细胞盐响应分析Fig.4 Effect of GhRab7 expression in yeast under salt stresses

3 讨 论

土壤盐害扰乱植物细胞内离子平衡、降低代谢活性，进而严重影响作物产量。植物通过调节生长和胁迫耐受性来适应或者避免不利的环境条件。棉花是世界范围内重要的经济作物。作为甜土植物，棉花比其他主要作物更耐受盐胁迫[19]。然而，种植区土壤盐碱化依然限制了棉花产量。已经知道盐胁迫诱导棉花GhSOS1基因的表达，拟南芥超表达GhSOS1转基因植株通过维持低水平Na+/K+和调节细胞内盐胁迫响应基因的表达而长势更好[20]；拟南芥超表达棉花GhTOM(G蛋白偶联受体)、GhWRKY34(转录因子)和GhPLATZ1(锌指类转录因子)也表现出更耐盐表型[21-23]。棉花盐胁迫响应基因的研究有助于优化栽培种质，提高棉纤维产量。

植物Rab蛋白参与花粉管生长[24]，叶片形态[25]，自噬[26]及抗病反应[25]等过程的调节。到目前为止，在酵母、哺乳动物和拟南芥中Rab相关成员调节质膜运输研究的比较清楚，然而棉花中Rab蛋白功能还没有很好的研究。此外，虽然Rab基因的保守性较高，但不同物种Rab基因个数和基因结构差异比较大[8]，不同植物Rab基因的研究将为Rab功能挖掘和应用到生产奠定 基础。

本研究从陆地棉中鉴定了一个Rab相关基因GhRab7；该基因编码蛋白含有5个保守的G区基序，这些基序在蛋白质三级结构上聚集形成一个鸟苷酸结合及水解功能域，该功能域与Rab活性密切相关；同时，该蛋白C末端保守Cys残基是Rab翻译后异戊烯化修饰位点，该位点修饰情况决定Rab与膜系统的结合，进而影响胞内囊泡融合过程[26]。

真核细胞主要通过膜上蛋白识别和感知外部环境信号，这些膜上蛋白包括能够引起细胞对外界环境信号响应的受体和感受子。已知拟南芥和水稻Rab7作为小G蛋白信号分子感知及响应外界环境盐胁迫[6,27]；转录因子通过识别顺式作用元件来响应各种环境信号；GhRab7基因上游含有多个盐胁迫响应顺式作用元件，暗示该基因可能通过转录因子与这些顺式作用元件结合来响应盐胁迫，这还需要更多的试验来证实。此外，酵母异源表达GhRab7也显示出不耐盐的特征。这些结果说明，棉花GhRab7可能具有响应非生物胁迫的能力。

本研究从棉花中克隆了GhRab7基因，该基因编码一个Rab类小G蛋白，推测其可能通过调节囊泡运输而介导胁迫响应过程。本研究结果为进一步明晰Rab类蛋白的生物学功能及胁迫响应调控机制奠定了基础。