川芎嗪对肾透明细胞癌增殖和侵袭作用及其机制的研究①

曹艳华 薛 霞 李 娟 曹佩华 栾 云

(山东大学第二医院药学部,济南250033)

肾透明细胞癌(Renal clear cell carcinoma,RCC)简称肾癌，是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤之一，在泌尿生殖系统恶性肿瘤中占第二位，在肾癌发病患者中大约有25%的肾癌患者发展成为晚期肾癌或者转移肾癌[1,2]。随着现代人生活饮食方式的改变，RCC的发病率越来越高，也越来越年轻化[3]。但其发病原因尚不明确，主要与内在基因和环境因素有关。目前，RCC缺乏早期的诊断标志，晚期的和转移的RCC常对化疗药物(如吉西他滨、长春新碱、5-氟尿嘧啶等)和激素不太敏感，同时对细胞因子如干扰素α、IL-2等的治疗有效率也偏低，且长期使用的副作用较大，因此，目前的治疗手段很难为进展期行手术治疗后的患者提供持续有效的后期治疗，迫切需要对传统的治疗方法进行革新[4]。据统计，有局部侵袭的肾透明细胞癌患者行肾癌根治术后复发率高达35%～65%[5]。因此，寻找新的方法来提高患者的生存率、无复发生存率以及生活质量十分有意义。

伞形科植物川芎是我国的传统中草药，具有良好的活血化瘀功效，在我国应用历史悠久，其提取单体川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是它的主要有效成分之一[6]。川芎嗪是一种生物碱，无色针状结晶，熔点80～82℃(显微测定)，沸点190℃。具有异臭，有吸湿性，易升华，易溶于二甲基亚砜、石油醚，溶于氯仿、稀盐酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。具有明确的化学结构，为四甲基吡嗪，自1957年被分离提纯以来，其人工合成工艺已日臻成熟。目前，该药已广泛应用到多种疾病的治疗和预防之中[7,8]。近年来，川芎嗪的抗肿瘤作用在许多研究中得到了证实，越来越多的学者开始关注该药在抗癌方面的作用。

上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)在肿瘤的侵袭和转移过程中扮演了重要角色，肿瘤细胞EMT的程度直接决定了肿瘤的恶性程度[9]。 EMT发生时伴有显著的形态学改变，表现为上皮样细胞少而间质细胞增多。 EMT最显著的特征是上皮标志物N-cadherin间质细胞标志蛋白和有关的转录因子表达上调[10]。 EMT可通过不同的信号通路如Notch、 Wnt 等通路激活，这些分子通路受到细胞内转录因子 Snail 和 Slug 的调控来诱导EMT的发生[11]。

因此，本研究采用RCC细胞系A498，主要探讨川芎嗪是否通过促进EMT相关蛋白表达从而影响RCC恶性生物行为。

1 材料与方法

1.1材料 川芎嗪单体购自中国食品药品检定研究院；肾透明细胞癌A498细胞购自中科院上海细胞库；6周龄雄性裸鼠由山东大学动物实验中心提供；蛋白定量试剂盒、SDS凝胶试剂盒、二甲基亚砜(DMSO)细胞裂解液、结晶紫、高锰酸钾、草酸、冰醋酸和磷钨酸均购自西安科昊生物有限公司；蛋白酶抑制剂购自罗氏试剂生物有限公司；高糖DMEM培养基、优级胎牛血清、胰蛋白酶消化液均购自美国 HyClone；青链霉素混合液、4%多聚甲醛、天狼星红染液、苯胺蓝和苏木素均购自北京碧云天有限公司，Actin、N-cadherin、Snail和Slug抗体、兔二抗购自英国 Abcam；ECL化学发光试剂盒购自美国 Advansta；Transwell小室购自康宁。

1.2方法

1.2.1MTT增殖实验 川芎嗪单体先用DMSO溶解再用PBS溶解为20 mg/ml的母液，pH=7.4。A498细胞计数4×105铺板，培养条件 5%CO2，37℃孵箱分别培养24、48和72 h。随后每孔加入20 μl的MTT，孵箱放置4 h后吸取培养液，每孔加入150 μl 二甲基亚砜，振荡15 min。酶标仪570 nm 测吸光值。

1.2.2克隆形成实验 对数生长期A498细胞，胰蛋白酶消化计数，6孔板，每孔300个细胞，2 ml培养液，培养15 d后，PBS冲洗，室温风干，结晶紫染色，计数。

1.2.3Transwell迁移实验 胰蛋白酶消化对数生长期A498细胞，无血清的DMEM培养液调整细胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培养液600 μl，上室加入200 μl无血清DMEM细胞悬液。铺板12 h后PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室温自然风干。随后结晶紫染色10 min，PBS冲洗3次，棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞，33%乙酸脱色，酶标仪570 nm读值。

1.2.4Transwell侵袭实验 胰蛋白酶消化对数生长期A498细胞，无血清的DMEM培养液调整细胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培养液600 μl，上室先铺水化的BD胶基底膜，再加200 μl无血清细胞悬液。铺板24 h后PBS冲洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室温自然风干。随后结晶紫染色10 min，PBS冲洗3次，棉签轻轻擦去上层未迁移的细胞，33%乙酸脱色，酶标仪570 nm读值。

1.2.5裸鼠皮下荷瘤模型 裸鼠随机分为阴性对照组和川芎嗪给药组各7只，对数生长期的A498细胞，调整至5×106个/200 μl，将细胞在无血清DMEM培养液中混匀，分别接种至两组裸鼠，给药组，川芎嗪5 mg/kg每3 d腹腔给药1次。裸鼠7 d后皮下成瘤，游标卡尺测肿瘤大小，每2 d测1次，长径(a)和短径(b)，计算肿瘤体积：公式(V) =ab2/2。

1.2.6Western blot 调整A549细胞数4×105个/孔，直接铺板接种6孔板，培养箱设定37℃、5%CO2进行培养，80%细胞密度时收集细胞，PBS洗涤1 min后加含有蛋白酶抑制剂的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速离心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上样缓冲液，沸水煮5 min。SDS-PACE电泳后进行转膜操作，转膜成功后用脱脂牛奶进行封闭，PBST清洗，均为1∶1 000稀释一抗，室温孵育1 h后4℃过夜。次日反复清洗条带，加二抗室温孵育90 min，PBS反复冲洗，发光拍照。

2 结果

2.1不同浓度川芎嗪处理后抑制A498细胞增殖能力 不同浓度的川芎嗪作用 A498 细胞 24、48、72 h 后，MTT 比色法测得的各组OD570值。统计学分析，各处理组(≥0.2 mg/ml)与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪处理组能有效抑制 A498 细胞的增殖，并随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖的抑制率增加(P<0.05)。当川芎嗪的药物浓度<0.2 mg/ml时，对细胞的抑制作用不明显(P>0.05)，即使时间延长未见明显的抑制作用。以川芎嗪作用24 h细胞的存活率分别为 98.7±8.8、93.6±6.4、90.2±5.1、82.3±4.6、63.6±5.3;作用48 h的细胞存活率为 95.6±8.7、90.2±6.2、82.3±5.7、73.6±6.2、52.9±4.4；作用72 h的细胞抑制率为94.3±7.1、86.6±6.3、72.3±5.7、61.2±6.4、40.6±3.8。川芎嗪作用24 h的IC50约为1.24 mg/ml，48 h的IC50约为0.1.05 mg/ml，72 h的IC50约0.95 mg/ml。川芎嗪对A498细胞增殖的抑制用在一定的浓度(≥0.2 mg/ml)和时间范围内，表现出时效与量效关系。见图1。

2.2不同浓度川芎嗪处理后抑制A498细胞克隆形成能力 分别以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪处理A498 细胞，与0 mg/ml相比，其余各组均抑制了A498，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显(P<0.05)， 见图2。

2.3不同浓度川芎嗪处理后抑制A498细胞迁移能力 分别以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪处理A498 细胞，与0 mg/ml相比，其余各组均抑制了A498的迁移能力，且随着药物浓度的增加，抑制作用显著增加(P<0.05)，见图3。

2.4不同浓度川芎嗪处理后抑制A498细胞侵袭能力 分别以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪处理A498 细胞，与0 mg/ml相比，其余各组均抑制了A498细胞的侵袭能力，且随着药物浓度越大，侵袭能力抑制作用越明显(P<0.05)，见图4。

2.5川芎嗪抑制了肾透明细胞癌在裸鼠体内的增殖能力 以5 mg/kg川芎嗪给药处理，27 d后处死小鼠，测肿瘤大小并绘制肿瘤成长曲线，结果显示川芎嗪处理组显著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长。从肿瘤生长曲线可以看出川芎嗪给药处理后肿瘤生长明显被抑制，且肿瘤体积较对照组显著减小，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5。

图1 不同浓度的川芎嗪作用不同时间对 A498 细胞增殖的影响Fig.1 Effects of different concentrations of ligustrazine on proliferation of A498 cells at different timeNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

图2 不同浓度川芎嗪处理后A498细胞克隆形成能力Fig.2 Cloning ability of A498 cells after treatment with different concentrations of tetramethylpyrazineNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

图4 不同浓度川芎嗪处理后A498细胞侵袭能力影响Fig.4 Effects of different concentrations of ligustrazine on invasive ability of A498 cellsNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

图5 川芎嗪对肾透明细胞癌在裸鼠体内的增殖能力影响Fig.5 Effect of ligustrazine on proliferation of renal clear cell carcinoma in nude mice

图6 不同浓度川芎嗪处理后A498细胞EMT标志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表达的影响Fig.6 Effects of different concentrations of ligustrazine on expression of EMT marker proteins N-cadherin,Snail and Slug in A498 cells

2.6川芎嗪抑制了肾透明细胞癌EMT机制 川芎嗪对A498细胞中EMT标志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表达的影响，由Western blot结果可知,随着浓度和时间的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表达(P<0.05)，见图6。

3 讨论

川芎为伞形科植物川芎的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛、行气开郁等诸多功效。川芎嗪是从川芎根茎中分离的药理活性成分之一，长期以来被广泛应用于预防和治疗缺血性脑中风和心血管疾病。除了在传统领域的应用外，川芎嗪一些新的药理活性陆续被发现，如对抗自由基，改善微循环以及抗肿瘤作用[24]。现有研究表明川芎嗪对肺间质纤维化、术后肠黏连性的肠梗阻、过敏性紫癜等疾病均有疗效。此外，川芎嗪在肿瘤的预防和治疗方面的作用也日益得到重视。其中有文献报道TMP能提高NK细胞活性及通过抑制可溶性MICA表达水平避免抑制NK细胞毒性从而起到抑制肿瘤的作用；在体内和体外TMP通过下调NF-κB表达抑制骨肉瘤细胞增殖，通过下调趋化因子受体CXCR4表达保护神经细胞抑制神经胶质瘤，通过调节ERK1/2和p38信号通路从而减少白细胞介素的表达，从而抑制人类卵巢癌的迁移，以及通过多种调节抑制肝癌、乳腺癌的增殖迁移等[25]。研究发现川芎嗪能够保护血管内皮，能对损伤后的血管内皮细胞的修复起到保护作用。川芎嗪还能对肾功能产生影响，具有明显的利尿作用，增加肾血流量，提高肾小球的滤过率；对中枢神经系统起到镇痛镇静的作用；减少炎症反应；对癌症的某些过程产生抑制作用等[26]。

肾癌导致死亡的主要原因是由于肾癌细胞在体内的增殖形成新的转移病灶。大多数肾癌患者被发现是多处于晚期，因为肾癌细胞已经在体内转移增殖，因此肾癌细胞在体内增殖能力的强弱对肿瘤的发生发展显得尤为重要[12,13]。因为肿瘤的恶性生物学行为主要包括了肿瘤细胞的增殖以及其侵袭能力。细胞基因突变可能是导致肿瘤细胞获得无限增殖的能力，而肿瘤细胞的增殖能力对肿瘤在体内的增殖生存起到至关重要的作用[14]。本研究通过MTT和克隆形成实验，检测了川芎嗪单体对肾透明细胞增殖能力的影响，结果发现0.4 mg/ml川芎嗪处理肾透明细胞癌A498细胞48 h后可以显著抑制其增殖能力和克隆形成，1 mg/ml作用72 h后抑制作用更加明显，说明川芎嗪对肾透明细胞癌A498细胞增殖能力具有显著的抑制作用。细胞迁移和侵袭能力是肿瘤细胞在体内转移到远端形成新病灶的主要原因[15]，特别是肿瘤细胞的侵袭能力越强，其对正常组织的侵润能力越强，大多数肿瘤患者死亡原因都是后期肿瘤在体内扩散转移形成多处病变最终导致死亡的。因此针对肾透明细胞癌的转移和侵袭能力研究一直是其治疗的研究热点[16,17]。本研究中，透过Transwell下室迁移和侵袭实验模拟肿瘤细胞在体内的转移和侵袭环境，结果发现川芎嗪可以很好地抑制肾透明细胞癌A498细胞的迁移和侵袭能力，为川芎嗪的抑癌作用研究提供了有力的证明。

EMT是肿瘤发生转移和侵袭最经典分子机制，肿瘤细胞发生EMT的程度直接决定了肿瘤细胞的恶性程度[18]。肿瘤细胞发生EMT时最显著的特征是间质细胞标志蛋白N-cadherin表达上调[19]。同时肿瘤细胞内Notch/Wnt 等通路信号活化可以激活肿瘤细胞内转录因子Snail和Slug来调控诱导 EMT 的发生[20]。N-cadherin作为EMT的标志蛋白在正常组织中表达很低，细胞发生癌变后其表达量增加促进EMT的发生并促使血管再生，增加肿瘤细胞的侵袭和转移能力[21,22]。Snail是一类具有锌指结构的转录因子其可以与Smad 相互作用促进N-cadherin的表达，从而增加肿瘤细胞的侵袭转移能力[23]。本研究通过Western blot 检测了不同浓度川穹嗪处理后A498细胞不同时间后EMT 标志物和调控因子蛋白表达水平的变化，结果川芎嗪同样显著抑制N-cadherin、Snail和Slug的表达。

本研究体外细胞实验表明川芎嗪抑制肾透明细胞癌A498细胞的增殖能力、细胞迁移和侵袭能力，说明川芎嗪可以抑制肾透明细胞癌的转移和形成远端病灶的能力。此外，体内动物实验结果显示川芎嗪显著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生长，结果同细胞实验一致。Western blot结果可知,随着给药浓度和时间的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表达，抑制EMT发生从而抑制肾透明细胞癌的增殖、转移和形成远端病灶。

综上所述，本论文首次研究中药提取物川芎嗪对肾癌细胞A498的增殖、迁移和侵袭能力的体内和体外研究，同时首次探讨了川芎嗪对肿瘤发生转移侵袭经典途径EMT机制的影响，发现川芎嗪在体内外可以通过抑制EMT发生从而抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。川芎嗪在肾透明细胞癌中最先结合并发挥作用的首触分子是如何具体影响EMT发生的，有待于进一步的研究探索。