PAI/ITI双模态PtCu纳米框架介导光热-放疗联合消融肿瘤实验研究

李晓楠，李景华，李星星，鲍建峰

河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳 471003； *通讯作者 李景华 anubiss1860@163.com

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重要疾病，对其可视化诊疗是当前医学研究的前沿热点[1]。多模态纳米影像探针的研究为肿瘤精准诊疗提供新策略。研究者利用纳米材料优异的理化性能，使纳米材料在实现影像诊断的同时，具有可设计的个性化肿瘤治疗能力[2]。光热治疗（photothermal therapy，PTT）是目前热门的新型肿瘤手段，利用具有近红外（near-infrared，NIR）光热转换性能的金[3]、石墨烯[4]、普鲁士蓝[5]、聚多巴胺[6]以及黑色素[7]等纳米材料实施光热治疗，可选择性地杀伤肿瘤而不损伤周围正常组织，具有更高的生物相容性和治疗安全性，是一种理想的肿瘤诊疗新手段[8]。本研究制备叶酸修饰的凹八面体 PtCu纳米框架，利用叶酸的靶向作用将材料递送至肿瘤部位，利用PtCu纳米框架可吸收NIR光的性质进行光热转换，同时通过Pt的重原子效应实施增强放疗，在NIR激光和X射线辐照下实现协同消融HeLa肿瘤细胞[9]；继而考察PtCu纳米框架的体内外光声成像/红外热成像双模态成像性能，以实现治疗过程监测的可视化，为后续临床应用提供理论及实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 乙酰丙酮铂[Pt（acac）2，99%]，乙酰丙酮铜[Cu（acac）2，99%]，油酸（OAM，80%～90%），十六烷基三甲基溴化胺（CTAB，99%）及叶酸（99%）购置于Sigma公司（美国），巯基-聚乙二醇-氨基（SH-PEG-NH2，Mw≈5000）购买于Jenkem公司（美国），其他常用化学试剂购置于阿拉丁公司（中国）；扫描电子显微镜（Nova 400-TEM，飞利浦，荷兰）、球差校正透射电子显微镜（Titan G2 80-200，赛默飞，美国）。

1.2 PtCu纳米框架的制备和表征

1.2.1 PtCu纳米框架制备 利用热溶剂法乳制备PtCu纳米框架。将 36.7 mg Pt（acac）2和 129.4 mg Cu（acac）2共同溶解于20 ml油酸，N2保护下继续加入660 mg CTAB，搅拌至完全溶解，将上述浅黄色溶液加入50 ml聚四氟乙烯内衬高压反应釜中，于175℃条件下持续反应48 h，待反应结束后冷却至室温，以8000 r/min离心，即得黑色PtCu纳米框架。

1.2.2 PtCu纳米框架接枝聚乙二醇 将 1.0 mmol/L PtCu纳米框架和3.0 mmol/L SH-PEG-NH2共同溶解于50 ml蒸馏水中，超声5 min使颗粒分散，持续机械搅拌12 h。以12 000 r/min离心，用透析膜（10 kD）透析24 h，即得PEG化PtCu纳米框架，记为PtCu-PEG。

1.2.3 叶酸表面修饰 将PtCu-PEG（20.0 ml，0.1 mmol/L）溶解于含0.2 mmol/L叶酸的双蒸水中，加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，50.0 mg）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，25.0 mg）反应6 h，得叶酸修饰的 PEG化PtCu纳米框架，记为 PtCu-PEGFA。

1.2.4 PtCu纳米框架理化性能检测 通过扫描电子显微镜和投射电子显微镜观察颗粒形貌；使用NanoZS电位分析仪测量所制纳米框架的表面电位情况；X射线光电子能谱（XPS）仪检测元素构成，光声成像仪和NIR热成像仪检测PtCu-PEG-FA的光声成像（PAI）/近红外热成像（ITI）双模态体外成像情况。

1.2.5 NIR 光热性能研究 将 200 μg/ml PtCu-PEGFA纳米框架分别溶解于水（H2O）、磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水（Saline）、培养基（Culture medium）中，采用808 nm、5 min、2.4 W/cm2参数NIR激光进行照射，记录其在不同溶剂中的产热情况。

1.3 细胞培养 将人子宫颈癌 HeLa细胞用含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素双抗的DMEM培养基进行培养，细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液。

1.4 肿瘤细胞杀伤效力检测 将HeLa细胞分别设定为对照组、PtCu-PEG-FA组、单纯 X射线放疗组、PtCu-PEG-FA+X射线增强放疗组、PtCu-PEGFA+NIR光热治疗组、PtCu-PEG-FA+NIR+X射线联合治疗组。实验中NIR激光参数为808 nm、5 min、2.4 W/cm2；X射线参数为10.0 Gy、10 min。利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5 体内PAI/ITI成像性能检测 利用光热声成像仪（VecoL，VisualSonics公司，加拿大）记录不同浓度PtCu-PEG-FA纳米框架的PAI信号强度。用NIR光热成像仪（P20，FLIR-Systems公司，美国）检测PtCu-PEG-FA纳米框架ITI信号强度。

1.6 统计学方法 采用 OriginPro（version 8.0）软件进行方差分析和独立样本t检验。对纳米框架的体内外PAI成像效果检测结果进行后续统计学分析，光热治疗协同增强放疗联合治疗组与对照组、单独增强放疗组和单独光热治疗组小鼠实体肿瘤体积组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PtCu-PEG-FA理化性能表征 颗粒呈现典型凹八面结构，分散性良好，粒径分布均匀，大小（65.32±4.37）nm。球差透射电镜元素分布及XPS均证实纳米框架的主要构成元素为Pt和Cu。紫外-可见光光谱结果显示材料在NIR光区有较好的吸光性质，可用作NIR光热材料。PtCu-PEG-FA框架的Zeta电位为（7.80±1.54）mV，与电负性细胞膜具有较好的亲和性（图1）。

2.2 产热性能表征 200 μg/ml PtCu-PEG-FA即可使体系温度升高超过50℃，达到肿瘤热疗温度。同时，200 μg/ml PtCu-PEG-FA纳米框架在不同溶剂中均可稳定分散，NIR辐照下均能超过50℃，实现有效的肿瘤光热消融（图2）。

图1 材料理化性能表征。A：PtCu-PEG-FA的扫描电镜图；B：PtCu-PEG-FA的透射电镜图；C：单个PtCu纳米框架的元素分布图；D：PtCu-PEG-FA的XPS谱图；E：PtCu-PEG-FA的近红外吸收光谱；F：材料Zeta电位图

图2 PtCu-PEG-FA的光热性能表征。A：不同浓度PtCu-PEG-FA的近红外光热性能表征；B：PtCu-PEG-FA在不同分散溶剂中的光学照片；C：PtCu-PEG-FA（200 μg/ml）于不同分散溶剂中的光热性能表征（NIR参数为808 nm、5 min、2.4 W/cm2）

2.3 体外成像

2.3.1 光声成像 不同浓度PtCu-PEG-FA在经NIR辐照时均出现光声信号，其PAI信号（红色）随浓度升高而增强；而双蒸水组基本无PAI成像信号。200 μg/ml组与双蒸水对照组相比，其信号值增加明显，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

2.3.2 红外热成像 不同浓度 PtCu-PEG-FA 在经NIR辐照时显著升温（图3），200 μg/ml PtCu-PEGFA即可使溶液体系升高至约60℃，达到热杀伤肿瘤细胞的有效温度。

图3 多模态成像性能。A：NIR辐照下材料体外PAI成像性能，红色部分代表PAI信号强度；B：NIR辐照下材料体外ITI成像性能，色彩代表ITI信号强度，最低温度在伪彩图上表现为黑色，最高温部分在伪彩图上表现为白色（NIR参数为808 nm、5 min、2.4 W/cm2）

2.4 细胞毒性检测 不同治疗组对HeLa细胞的杀伤效力见图4。PtCu-PEG-FA+NIR+X射线光热和增强放疗联合治疗组较对照组、单独PtCu-PEG-FA+X射线增强放疗组和单独PtCu-PEG-FA+NIR光热治疗组的凋亡坏死情况（Q2+Q4区）更加明显，表明PtCu纳米颗粒具有较好的光热和放疗增敏效果，能够有效杀伤消融肿瘤细胞。

图4 流式细胞仪测定不同治疗组的细胞毒性。A～F分别为对照组、PtCu-PEG-FA组、单纯X射线放疗组、PtCu-PEG-FA+X射线增强放疗组、PtCu-PEG-FA+NIR光热疗组、PtCu-PEG-FA+NIR+X射线联合治疗组

2.5 体外成像及实体肿瘤治疗表征 结果显示 PtCu纳米框架具有良好的PAI性能，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。ITI结果显示，材料经NIR辐照可使瘤区温度显著升高，可有效杀灭肿瘤细胞。在X射线联合治疗18 d后，肿瘤体积明显减小或完全消失，具有较好的治疗效果（图5）。

2.6 组织相容性验证 HE结果显示，PtCu-PEG-FA经尾静脉注射至小鼠体内 28 d后，未对小鼠主要器官造成明显的组织学损伤，显示出材料具有较好的生物相容性（图6）。

图5 体内成像表征及动物实体肿瘤消融表征。A：体内肿瘤光声成像图；B：体内肿瘤热成像图；C：各治疗组18 d后取出实体肿瘤的光学照片；D：18 d内各治疗组的肿瘤体积变化表征

图6 PtCu-PEG-FA尾静脉注射28 d后小鼠主要器官组织切片（HE，×400）

3 讨论

光热治疗法利用具有高光热转换效率的纳米材料，经NIR激光辐照，在瘤区原位产生超过40℃的高温以热杀伤肿瘤细胞，具有组织穿透性好、选择性高、对正常组织损伤小等优点[10-12]；且可根据不同影像诊断要求对纳米光热制剂进行定制和表面改性，使其具有MRI、CT、超声成像、活体荧光成像、光声成像、红外热成像等特性，实现诊疗过程的可视化监测[13-15]。同时，利用对纳米制剂本身的理化特性还可以实现其他生物功能，如携带化疗药物进行联合化疗，使用重金属实现增强放疗，利用材料的共轭π键开展协同光动力治疗等[16]。这种多模态成像介导的多功能化纳米肿瘤诊疗平台能够更特异性、更精准和更有效地实现肿瘤的可视化定点消融[17]。

基于此，本研究设计开发了一种同时具有光热和增强放疗效力的PtCu纳米框架。该纳米框架形貌规则，粒径分布均匀，所制备材料显示出优异的NIR激光光热性能。在808 nm NIR激光辐照下，极低浓度的PtCu纳米框架（200 μg/ml）即可使体系升温超过50℃，进而利用肿瘤的热不耐受特性，实现对肿瘤病灶的选择性杀伤；并且利用 Pt的重原子效应实施增强放疗，进一步提高治疗效率。此外，由于PtCu纳米框架良好的NIR光吸收及光热转换特性，可用作光声成像造影剂标记肿瘤部位，实现治疗过程可视化，并可用NIR成像监控肿瘤部位的实时升温情况，防止过热灼伤，提高治疗过程的安全性。

本研究所开发的一种PAI/ITI双模态成像介导可视化纳米诊疗平台，基于PtCu纳米框架的NIR光热性能和增强放疗性能，在PAI/ITI成像引导下，开展光热-放疗增敏联合作用消融实体肿瘤，实现了优于单独光热或单独放疗的肿瘤抑制效果。为开发同时具有诊断影像探针和肿瘤治疗能力的纳米诊疗平台提供新思路。但实验对材料作用细胞的靶向机制及内吞途径尚未完全明确；未对PtCu纳米框架的组织相容性进行评价，缺乏长效生物安全性相关评价；材料在动物体内的药代动力学、组织分布及代谢途径均有待证实，后续将开展实验进行深入探索。