核桃青皮乙醇提取液体外抑茵实验的研究

韩晓云 刘鹏 王震 范学红

摘要：采用平皿打孔法与生长速率法探究了核桃青皮乙醇回流提取物对3种肠道致病茵及3种霉菌性真菌的抑茵活性，为开发新型抗感染药物提供试验依据。结果显示：不同浓度核桃青皮乙醇提取物对几种供试茵均有不同程度的抑茵活性。其中对大肠杆茵0157：H7的抑茵效果好于沙门氏茵和福氏志贺茵，而对真菌的抑茵效果，则是对青霉菌效果强于根霉菌，而对葡萄孢霉菌的抑制效果较差。

关键词：核桃青皮;肠道致病菌;抑茵活性

中图分类号：$664文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）14-0218-02

1引言

从亚历山大·弗莱明1929年发现了青霉素，到1942年青霉素的大規模商用，抗生素的出现帮人类解决了很多问题，肺结核、炭疽等疾病都能得到治愈，所以抗生素被称为人类的健康卫士并不为过。但随着抗生素大量使用、滥用，也带了很多其他问题，如耐药菌的产生。目前耐药菌种几乎无处不在，极大地影响了医治效果，对人体的健康有着无可估量的危害，因此寻找新型抗生素，脱离对现有抗生素的依赖成为改善耐药现状的一个途径。

核桃青皮又称青龙衣，为成熟核桃的外果皮。在中医验方中，核桃青皮可用于治疗皮肤瘙痒及疼痛等病症。现代研究也有大量的试验表明核桃青皮具有较好的抑菌效果。商洛作为著名的核桃之乡，核桃年产量为全国第一，同时核桃青皮作为核桃收获中产生的农林废弃物，有着巨大的存量。核桃青皮作为一种宝贵的可再利用资源，其抗菌药用价值值得深入开发和利用。

目前关于核桃青皮体外抑菌试验做的较多，但大多集中在葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等菌株，其对沙门氏菌、大肠杆菌0157：H7、福氏志贺菌等肠道致病菌的抑菌作用研究较少。本试验主要研究核桃青皮乙醇提取液对肠道致病菌及真菌性致病菌的抑菌作用，以期为后续开发新兴抗生素提供理论依据。

2材料与方法

2.1材料与仪器

2.1.1供试植物材料

核桃为商洛市洛南县所产，自然成熟后人工剥取核桃青皮备用。

2.1.2供试菌种和试剂

大肠杆菌0157：H7、肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌、青霉菌、葡萄孢霉菌、根霉菌、PDA培养基、MH培养基。

2.2买验方法

2.2.1样品干燥处理

剥去新鲜核桃青皮，采用冷冻干燥法进行处理。冷冻条件为：压力10Pa，温度-45℃，含水率为3.28%。待样品充分干燥后，进行粉碎并过40目筛，备用。

2.2.2核桃青皮萃取液的制取

称取冷冻干燥的样品粉末10.00g，加入200mL95%乙醇溶液，65℃下回流提取8h，将提取物进行过滤后再浓缩，再将浓缩液用水定容至100mL，相当生药含量为100mg/mL，作为实验母液。各取母液10mL，用蒸馏水稀释至生药含量为100、80、60mg/mL，并依次标记为M1、M2和M3，用于抑菌实验。

2.2.3指示茵准备

2.2.3.1细菌指示菌准备

先对细菌菌株复苏，采用平板划线法于37℃恒温培养箱连续培养18h使其复苏。再挑选单个菌落于相应液体培养基在37℃下连续培养12h进行增菌，离心收集菌体，在菌体中加入一定量的生理盐水进行稀释，使稀释液OD600吸光值为0.1（细菌数量为10⁸cfu/mL），冷藏菌液备用。

2.2.3.2真菌指示菌准备

将菌株用接种环接种到PDA培养基，28℃恒温培养7d，待出现菌斑冷藏备用。

2.2.4细菌指示茵抑茵实验

2.2.4.1试验平板的制备

预加菌液倾注平板法：称取MH培养基粉末21.0g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min，待冷至50℃，将上述稀释好的菌液1mL注人并混合均匀（试验平板中活菌浓度约为10⁵cfu/mL），倾注培养皿水平静置，待凝固后备用。

2.2.4.2抑菌圈直径测定

选用平皿打孔法测定核桃青皮乙醇提取物对3种肠道致病菌的抑菌作用。将琼脂打孔器灭菌后在试验平皿上进行等距离打孔，分别往不同的孔中注入100uL的M1、M2、M33种不同浓度的待测核桃青皮乙醇提取液，每个待测液做3个平行试验，测定3种浓度的待测液的抑菌效果。用等量无菌生理盐水作阴性对照。全部注入后，将培养皿在4℃进行预扩散2h后，方放人37℃恒温培养液持续培养24h。待培养结束，用十字交叉法测定抑菌圈直径大小。抑菌能力的强弱由抑菌圈直径的大小来，亦可用抑菌率来表示。抑菌率计算公式如下：

抑菌率（%）=（试验组抑菌圈直径一空白对照抑菌圈直径）/试验组抑菌圈直径×100%。

2.2.5真菌指示菌抑菌试验

2.2.5.1试验平板的制备

称取46g的PDA培养基于1000mL无菌水中，熔化后灭菌，待培养基冷却至50℃左右，将其倒入培养皿等待冷却凝固备用。

2.2.5.2抑菌直径测定

采用生长速率法来测定提取物的抑菌活性。用移液枪取100uL的M1、M2、M33种不同浓度的待测核桃青皮乙醇提取液和对照液注入不同的PDA培养皿中，用一次性涂布棒涂抹，使其待测液与对照液均匀分布于平板。用灭菌琼脂打孔器取3mm菌片，小心移到涂有待测液的PDA平板上，每个处理做3个平行试验，完成后将各平皿放人28℃恒温培养箱中培养72h，测定抑菌圈直径。试验过程中要无菌操作，并做好标记。

真菌菌落直径=测量直径平均值-3mm。

抑菌率（%）=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%。

3结果与分析

3.1核桃青皮乙醇提取液对3种肠道致病菌的抑菌效果

核桃青皮中存在着丰富的抑菌或杀菌活性物质，95%乙醇回流提取的不同浓度核桃青皮提取液均对3种供试肠道致病菌有一定的抑菌效果，结果见表1。提取物浓度不同，对3种细菌的抑菌作用也不同，对相同的供试菌，抑菌圈直径M1>M2>M3，这表明浓度高低与抑菌圈直径大小呈正相关性，即抑菌效果呈现剂量依赖效应。在3种供试菌中，对大肠杆菌0157：H7的抑菌效果最好，其次是腸炎沙门氏菌与福氏志贺菌。其中浓度为100mg/mL的M1提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径达到了16.3mm，抑菌率高达81.6%。阴性对照组无菌水及95%乙醇对照试验均无抑菌效果。

3.2核桃青皮乙醇提取液对霉菌性真菌的抑茵效果

不同浓度核桃青皮乙醇提取液对霉菌性真菌的抑菌效果如表2所示，95%乙醇回流提取的不同浓度核桃青皮提取液对3种供试霉菌性真菌的抑菌圈直径不尽相同，表明提取物对不同的霉菌性菌株的抑菌效果具有差异性，抑菌作用从大到小依次为青霉菌>根霉菌>葡萄孢霉菌，对青霉菌的抑制效果最明显，对葡萄孢霉菌的抑制效果最差。对同一种供试霉菌的抑菌效果，提取物的浓度不同，抑茵效果也表现出了差异，浓度越大，抑菌效果越好，这提示提取物浓度与抑菌率呈正相关性，即抑菌效果呈现剂量依赖效应。其中浓度为100mg/mL的提取液对青霉菌抑菌率高达79.1%。阴性对照组中无菌水及95%乙醇对3种供试霉菌均无抑菌效果。

4讨论

现代科学研究表明核桃青皮中含有很多活性物质。目前从核桃青皮中分离出很多成分都具有一定的抑菌活性，如胡桃醌、胡桃素、4，8一二羟基-1-四氢萘酮、β-谷甾醇、芦丁、槲皮素、山萘酚等。张卫星等人。研究核桃青皮不同极性试剂提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、青霉菌、白色念珠菌等细菌和真菌的抑菌作用，结果表明各提取物均有不同程度的抑菌效果。王刚霞等人研究核桃青皮乙醇提取物对几种采后病原真菌抑制作用，结果表明提取物对供试菌均有明显的抑制效果。曹文利等人研究核桃青皮醇提物及碱提物对对链格孢菌的抑菌活性，结果表明核桃青皮醇提物在抗氧化和抑菌方面都有良好的效果。本研究也证实了核桃青皮乙醇提取物的抑菌效果，其对3种肠道致病菌及3种霉菌性真菌的生长繁殖均有一定的阻碍作用，但是由于各方面原因，关于核桃青皮乙醇提取物的抑菌机靼本实验未有涉及。许紫峻等人探究核桃青皮乙醇提取物抑制霉菌的作用机理，结果表明提取物主要通过增加菌体细胞膜通透性或破坏细胞膜使其破裂来抑制菌体的生长繁殖。任先伟等人研究核桃青皮各萃取相对金黄色葡萄球菌等7种细菌的抑菌作用及抑菌机理，结果表明各萃取相均有抑菌作用，且主要是通过损害菌体细胞膜通透性、细胞壁及细胞内容物来发挥抑菌作用。后期将继续深入探究核桃青皮乙醇提取物的抑菌机理。另外关于提取物是否对人体细胞和植物细胞有毒性，也需要进行深入探索与研究。

5结语

核桃青皮乙醇提取物对3种肠道致病菌及3种供试菌均有抑菌活性，其中对大肠杆菌和青霉菌的抑菌效果最好，而对福氏志贺菌及葡萄孢霉菌的抑菌效果相对较差。随后进一步从DNA及细胞结构角度深入探索核桃青皮的抑菌作用机理，以及其对人体细胞及植物细胞是否有毒性，以期为开发新型抗生素治疗临床肠道感染性疾病奠定理论基础，为对开发新型植物源性杀菌剂提供一种选择。